Раздел IV. Качество, технологии и безопасность пищи

Глава 31. Новые источники пищи: настоящее и будущее

Новые источники пищи, полученные методами современной биотехнологии

Снабжение разрастающейся человеческой популяции пищевыми продуктами уже в настоящее время является проблемой мирового масштаба, а достижение непрерывного роста объемов производства и расширения ассортимента сырья для пищевой промышленности может быть обеспечено только посредством использования новейших технологий, в частности биотехнологии.

Современная биотехнология, входящая в перечень критических технологий РФ (утверждены Указом Президента РФ № 899 от 07.07.2011), несомненно, является одним из наиболее перспективных и бурно развивающихся направлений, основанных на фундаментальных исследованиях и имеющих большое практическое значение. Она базируется на генной инженерии, что дает возможность получать ценные биологически активные вещества (антибиотики, гормоны, ферменты, иммуномодуляторы, синтетические вакцины, аминокислоты и др.), создавать новые сорта растений и породы животных. Среди потенциальных возможностей, которые открывает генная инженерия, — новые способы изменения структуры ДНК и РНК, манипуляций с генами, изменения генотипов целых организмов — микроорганизмов, растений и животных. Если генно-инженерно модифицированные (ГМ) микроорганизмы, широко применяемые в медицине, фармацевтике и пищевой промышленности, в основном привлекают внимание специалистов, то проблема использования ГМ-растений и, с недавнего времени, ГМ-животных, вышла далеко за рамки академических интересов и активно обсуждается обществом уже более 15 лет.

Современные методы селекции

Постоянное совершенствование живых объектов (растений, животных, микроорганизмов), используемых в хозяйственной деятельности человека, является важнейшей составляющей современного производства продовольственного сырья и пищевых продуктов. Необходимость повышения продуктивности растений и животных, придания им устойчивости к абиотическим стрессам (засухе, затоплению, засолению, высоким и низким температурам), снижения времени созревания обусловлена ростом человеческой популяции, сокращением пригодных для сельского хозяйства и животноводства земель, изменением климата [1, 3, 4].

До недавнего времени получение устойчивых, наследственно закрепленных полезных признаков было ограничено возможностями внутривидовой изменчивости организмов, прошедших этап доместикации [15, 19, 20]. Ведущим принципом селекционной работы является искусственный отбор, который не утратил своей значимости по настоящее время [9, 10, 15, 19]. Традиционные методы селекции, к основным видам которых можно отнести гибридизацию, полиплоидию, мутагенез, являлись научным продуктом в условиях отсутствия полноценной теории, раскрывающей структуру и механизмы функционирования наследственного аппарата, поэтому принятие решений для реализации селекционных целей и задач происходило в условиях неопределенности причины наследования полезного признака [6, 7]. Современные методы селекции можно с определенной долей условности противопоставить традиционным лишь на основании имеющихся знаний о естественной организации наследственного аппарата, при этом методы современной селекции в целом аналогичны методам традиционной селекции [5, 12, 15, 20].

Останавливаясь подробнее на методах селекции, следует отметить, что гибридизация является древнейшим из них и представляет собой процесс скрещивания двух или большего числа наследственно различающихся родительских форм, последовательно вовлекаемых в процесс скрещивания [2]. Выделяют естественную и искусственную гибридизации, отличающиеся тем, что при естественной гибридизации скрещивание происходит спонтанно, без участия человека, а при искусственной гибридизации скрещивание строго определено влиянием человека [10, 11, 15, 19]. Также принято разделять гибридизацию на внутривидовую, межвидовую и межродовую.

Преимущество внутривидовой гибридизации состоит в получении полезного признака, имеющего устойчивое наследственное закрепление, а также минимальный набор причин, ограничивающих скрещивание. К недостаткам этого метода можно отнести сложность получения новых полезных признаков, не свойственных организмам данного вида [19, 20].

Межвидовая гибридизация, напротив, позволяет существенно расширить возможность появления новых признаков, однако полученный таким путем признак может характеризоваться нестабильной наследуемостью в ряду поколений или совсем не передаваться из-за потери гибридами репродуктивной способности. Кроме того, межвидовая гибридизация не всегда возможна из-за расширения набора причин, ограничивающих скрещивание, что особенно актуально в селекции животных [21, 22].

Межродовая гибридизация позволяет сочетать в себе преимущества внутри- и межвидовой гибридизации, уменьшая отрицательные эффекты. В качестве примеров межродовых гибридов растений можно назвать гибрид пшеницы и ржи (тритикале), пшенично-пырейный гибрид, гибрид смородины и крыжовника (йошта), гибрид брюквы и кормовой капусты (кукурузника), гибриды озимой ржи и житняка, травянистого и древовидного томатов [7].

При разработке различных видов гибридизации немаловажную роль играет математическая статистика и планирование эксперимента [12, 21]. Так, особая организация процедуры гибридизации, регламентированная законами математической статистики, приводит к появлению особого вида гибридизации, называемого диаллельной [18, 23]. Суть ее сводится к комбинированию вариантов скрещивания пары одной линии с другой [18, 23]. Также на основе методов комбинаторики было сформировано целое направление селекции — комбинационная селекция, в основе которой лежит гибридизация с целью получения гетерозиготных организмов, а затем длительная гомозиготизация до 8-го поколения для получения стабильных нерасщепляющихся форм [12, 13, 19, 22, 23, 24].

С развитием физиологии происходит значительное расширение методологического потенциала традиционной селекции: появившееся учение о раздражителях привело к формированию новых методов селекции — полиплоидии и мутагенеза [15]. Суть этих методов сводится к тому, что объект селекции подвергается дозированному воздействию определенными раздражителями, которые классифицируются: по происхождению — на физические (температура, давление, облучение и т.п.), физико-химические (концентрированные солевые растворы), химические (колхицин); по силе воздействия — на подпороговые, пороговые, надпороговые и повреждающие; по адекватности — на адекватные и неадекватные, с целью получения физиологической реакции селекционного объекта, удовлетворяющей целям и задачам селекции — появлению стабильного, наследственно закрепленного полезного признака [13, 15, 25].

Впоследствии, когда сущность действия этих раздражителей стала ясна, данные раздражители стали называться мутагенами [15, 26]. Полиплоидия — это тип геномной мутации, выражающийся в кратном увеличении гаплоидного набора хромосом [26, 29, 30]. Было отмечено, что при воспроизводстве полиплоидии у объекта селекции можно добиться появления полезных признаков (например, морозоустойчивости растительных организмов, размеров плодов, пищевой ценности и т.д.), однако не все полиплоиды характеризовались такими положительными изменениями [11, 13, 15, 18, 19]. Отработка дозы раздражителя и методики раздражения позволили значительно повысить эффективность получения подобных мутантов [9, 10, 14, 25, 26]. В целом действие мутагенов сводится к изменению структуры генетического аппарата, которое может привести к появлению полезного признака, отбираемого из полученной выборки посредством искусственного отбора [7, 26].

2-я половина ХХ в. ознаменовалась открытиями в области молекулярной биологии, послужившими основой для развития генетической инженерии растений. В сущности, генетическая инженерия продолжает направление традиционной селекции по улучшению генотипа хозяйственно ценных культур, но достигает той же цели более коротким и эффективным путем [1, 23]. Среди потенциальных возможностей, которые открывает молекулярная генетика — новые способы изменения генотипа, а также продуктов отдельных генов, фенотипа клеток и целых организмов. По своим масштабам влияния на природу эти воздействия поистине безграничны и, помимо чисто научных проблем, неизбежно затрагивают проблемы социальные и этические [21, 35, 46, 60].

На сегодняшний день генетическая инженерия располагает значительным арсеналом знаний и приемов для осуществления переноса полезных генов из одних организмов в другие. В частности, к методам генной технологии относят синтез генов вне организма, выделение из клеток отдельных генов или наследственных структур, направленная перестройка выделенных структур, копирование и размножение выделенных (или синтезированных) генов или генетических структур, соединение разных геномов в одной клетке [1, 2, 3, 23].

Особенностью технологии создания генетически модифицированных (ГМ) растений является ее многоэтапность. При всей условности разделения можно выделить следующие основные этапы: получение целевых генов; создание вектора; трансформация растительных клеток; подтверждение трансформации молекулярно-биологическими методами — обнаружение функционирующего целевого гена; регенерация целого растения из трансформированных клеток (схема). Существует мнение, что достижение желаемого результата находится в прямой зависимости от двух основных условий: возможности генетической трансформации клеток определенных видов растений и возможности регенерации трансформантов до целых растений [5, 6, 60].

На первом этапе конструирования рекомбинантной ДНК готовят вставки, пригодные для последующего лигирования (соединения) с векторной молекулой. В настоящее время разработано и введено в практику 3 метода получения вставок: во-первых, из геномной ДНК, фрагментированной либо с помощью рестриктирующих эндонуклеаз, либо с помощью физических методов, например, ультразвука; во-вторых, путем синтеза фрагментов ДНК, полученных химическим или ферментативным методом, или посредством комбинации этих методов; в-третьих, из сегментов ДНК (кДНК), полученных с помощью ферментативного копирования РНК-матрицы in vitro [25, 28, 31].

Следует отметить, что в большинстве случаев целевой ген является модифицированным, так как, несмотря на универсальность генетического кода, состав кодонов, кодирующих одни и те же аминокислоты у про- и эукариот, существенно различается. Модификация необходима для исключения из гена последовательностей, которые потенциально могут служить местами полиаденилирования (обрыва транскрипции), а также дестабилизировать мРНК. Кроме того, в структурной части генов прокариот могут присутствовать нежелательные сигнальные последовательности, например, узнаваемые на уровне мРНК ферментами сплайсинга или деградации. Наличие таких скрытых сигналов ведет к резкому снижению экспрессии гена в растении, поэтому обычно их удаляют путем точечных замен оснований [4, 7, 10]. Для осуществления направленных точечных замен в кодирующих последовательностях есть набор рутинных методов, основанных на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Замена кодонов не сказывается на первичной структуре белка, при этом экспрессия гена может быть усилена 300-кратно [42].

Для того чтобы целевой ген должным образом экспрессировался в клетках растения, необходимо поместить его под контроль соответствующих регуляторных элементов, эффективно обеспечивающих транскрипцию, — промоторов, сайтов инициации транскрипции и терминаторов. Среди эукариотических организмов эти сигнальные элементы являются высококонсервативными и достаточно универсальными, поэтому растительные клетки в основном правильно экспрессируют чужеродные гены не только растений других видов, но и млекопитающих, дрожжей и других эукариот. Конститутивные промоторы применяются для наработки существенных количеств продукта соответствующего гена на протяжении всей жизни растения. Для двудольных растений такими эффективными промоторами являются, например, промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и nos-промотор гена нопалинсинтазы агробактерий; для однодольных — промоторы гена алкогольдегидрогеназы кукурузы (adh) и гена актина 1 риса (act). Известно, что среди промоторов, выделенных на сегодняшний день, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты — один из самых сильных, поэтому в большинстве случаев именно его используют в качестве регулятора экспрессии целевого гена [10, 30]. Помимо конститутивных существует большое число специфических промоторов, активных в отдельных органах, тканях или клетках, либо на определенных стадиях онтогенеза растения. В качестве примера можно привести промотор гена пататина картофеля, работающий только в клубнях [43]. Интенсивно изучаются и используются индуцибельные промоторы, которые активируются при воздействии определенных факторов — температуры, освещения, химических веществ. Индуцибельные промоторы весьма перспективны как для фундаментальных, так и для прикладных исследований (в частности, для биотехнологии), так как позволяют вызвать экспрессию гена в заданный период [32, 39, 54, 60].

Таким образом, вставка или кассета экспрессии плазмидного вектора, представляющая собой группу функционально связанных участков ДНК, состоит из высокоактивного промотора, непосредственно за которым располагаются целевой ген и терминатор транскрипции.

В качестве вектора (автономной молекулы ДНК, используемой в генной инженерии для переноса генов от организма-донора в организм-рецепиент), которым может быть любой небольшой внехромосомный элемент (плазмида, ДНК фага или вируса), для трансформации растительных клеток обычно используют плазмиды. Наиболее широко применяются такие комбинации, когда в роли промежуточного хозяина выступает штамм E. coli и его плазмида, а в роли окончательного хозяина — Agrobacterium tumefaciens и его плазмида [38, 49, 52].

Когда получены плазмида и вставка, начинается процесс конструирования плазмидных векторов, который заключается в расщеплении плазмиды соответствующими рестриктазами и последующим лигированием со вставкой. В зависимости от того, какие концы имеют вектор и вставка — липкие (комплементарные одноцепочечные участки молекулы ДНК, выступающие на противоположных концах двухцепочечной молекулы) или тупые (концы цепей двухцепочечной молекулы ДНК, заканчивающиеся парой соединенных комплементарных оснований), условия лигирования вектора и вставки имеют некоторые отличия. Так, липкие концы вектора и вставки соединяют с помощью ДНК-лигазы в условиях, способствующих образованию водородных связей между комплементарными участками; для объединения тупых концов ДНК-лигаза и фрагменты должны присутствовать в высоких концентрациях, поскольку лигаза имеет низкое сродство к тупым концам. Помимо лигирования вектора и вставки может происходить внутримолекулярное соединение этих двух компонентов (вектор–вектор, вставка–вставка), в результате чего выход рекомбинантных молекул снижается [13].

Проникновение изолированных ДНК в живые клетки E. coli наиболее эффективно проходит при условии повышенной проницаемости клеточных мембран, обусловленной, в частности, их локальным разрушением. Нарушение целостности мембран достигается либо посредством обработки клеток определенными химическими реагентами, либо воздействием электрического тока — электропорацией, после чего перенос плазмидной ДНК происходит в течение нескольких минут (эффективность трансформации, определяемая как число трансформированных клеток на 1 мкг добавленной ДНК, составляет 10⁷–10⁸, либо 10⁶–10⁹, соответственно) [3].

Необходимым условием успешного клонирования является возможность разделения всех трансфицированных клеток E. coli. Плазмидные векторы обычно содержат маркерные гены, благодаря которым клетки-хозяева приобретают удобный для отбора фенотип, свидетельствующий о присутствии у них данного вектора. Например, клетки, чувствительные к определенному антибиотику или токсину, можно использовать в комбинации с векторами, содержащими гены устойчивости к этим агентам. Выращивая микроорганизмы в условиях, при которых проявляется зависимость от векторных генов, можно идентифицировать, отобрать и размножить клетки, несущие требуемый генетический материал [63].

Получение рекомбинантной ДНК в количестве, необходимом для проведения модификации растительного генома, позволяет перейти непосредственно к ключевому этапу получения ГМ-культур. Существует целый ряд методов трансформации генома растений, среди которых можно выделить следующие: агробактериальный, баллистический, введение генов в растительные протопласты, а также некоторые альтернативные подходы (схема) [3, 6, 57, 60]. Эффективная доставка векторной ДНК в растительные протопласты осуществляется посредством электропорации, микроинъекций, упаковки ДНК в липосомы, слияния бактериальных сферопластов, химически стимулированного эндоцитоза [6]. В принципе, протопласты (растительные клетки с удаленной целлюлазами клеточной стенкой) являются наиболее подходящими рецепиентами рекомбинантной ДНК, поскольку представляют собой аналогичные бактериальным системы, в которых каждая клетка находится в компетентном состоянии и обладает выраженной способностью к пролиферации. Кроме того, по сравнению с многоклеточными трансформантами, в значительной степени снижены потери при селекции модифицированных клеток [57].

Альтернативные способы генетической трансформации по большей части являются экспериментальными разработками, которые отличает нетрадиционность применяемого подхода. Один из них — разработка векторов на основе органелл растительной клетки — митохондрий и хлоропластов, другой — генетическая трансформация с помощью транспозируемых элементов. Кроме того, существуют методы модификации растительного генома при использовании в качестве носителя рекомбинантной ДНК кремниевых волокон размером 0,6 МКМ в диаметре и 10–80 МКМ в длину; транспорта ДНК через ткани меристем посредством электрофореза; облучения микролазером для получения микроотверстий в клеточных стенках и мембранах для последующей инкубации перфорированных клеток в растворах векторной ДНК [6, 57, 60].

 В идеале трансформационная система должна отвечать определенным условиям, а именно — быть простой, дешевой и эффективной. Однако, несмотря на сравнительно широкий выбор методических подходов, всем требованиям не соответствует ни один из них. Тем не менее в настоящее время для производства ГМ-культур в промышленных масштабах в основном применяются агробактериальный и баллистический способы модификации растительного генома [19, 37, 48].

Бактерии рода Agrobacterium (A. tumefaciens, A. rhizogenes) принадлежат к роду Rhizobiaceae. Их отличительной чертой является способность вызывать развитие раковых опухолей (так называемых «корончатых галлов») у большого круга двудольных растений. При этом происходит перенос фрагмента агробактериальной Ti-плазмиды (Tumor inducing plasmid) — Т-ДНК (transfer DNA) в геном растительных клеток. Перенос Т-ДНК является уникальным природным процессом обмена генетической информацией между прокариотическими и эукариотическими организмами [15].

Процесс переноса Т-ДНК из агробактериальной в растительную клетку осуществляется при участии продуктов локуса вирулентности (vir), расположенного на Ti-плазмиде, а также хромосомных локусов chv и att, контролирующих прикрепление. Хромосомные локусы экспрессируются конститутивно, тогда как vir-локус, насчитывающий 10 оперонов (virA-J), индуцируется растительными метаболитами, такими как ацетосирингон, гидроксиацетосирингон [3, 15, 60]. При участии активированных ацетосирингоном продуктов vir-генов формируется однонитчатая линейная молекула Т-ДНК, которая проникает в ядро растительной клетки, где встраивается путем незаконной рекомбинации в растительную хромосому. Для осуществления интеграции Т-ДНК на правом ее фланге присутствует сегмент из 25 пар нуклеотидов, по-видимому, служащий рекомбиногенным сайтом интеграции [17], при этом переносится только последовательность, расположенная слева от этой области. Аналогичный сегмент, который, вероятно, помогает обозначить конец интегрируемого участка, встречается и на левом фланге Т-ДНК. Примечательно, что vir-регион Ti-плазмиды, детерминирующий перенос, не переносится в хозяйскую клетку [23, 47, 68]. Растительная клетка со встроенной Т-ДНК продуцирует ряд органических веществ, служащих специфическими для агробактерий источниками углерода и азота.

Таким образом, использование Ti-плазмид в качестве вектора рекомбинантной ДНК основано на встраивании нужного фрагмента в область Т-ДНК. Все векторы, сконструированные на основе Ti-плазмид, организованы сходным образом и включают следующие элементы: сайт инициации репликации, позволяющий плазмиде реплицироваться в E. coli; сайт инициации репликации А. tumefaciens; правая фланкирующая последовательность — рекомбиногенный сайт интеграции; левая фланкирующая последовательность; множественный сайт клонирования — полилинкерная последовательность для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК; селективный маркерный ген под контролем эукариотических регуляторных компонентов [3].

Из-за отсутствия уникальных сайтов рестрикции в молекуле Ti-плазмиды прямое включение в нее чужеродной ДНК невозможно, но существует способ встраивания генов в Т-ДНК. Саму Т-ДНК сначала клонируют в E. coli, с использованием плазмиды E. coli (в большинстве случаев это pBR322). Нужные сегменты ДНК встраивают в подходящие сайты рестрикции Т-ДНК выделенной плазмиды, полученные рекомбинанты повторно клонируют в E. coli. Затем рекомбинантную плазмиду вводят путем конъюгации в клетки А. tumefaciens, которые уже несут Ti-плазмиду дикого типа, и Т-ДНК с встроенным фрагментом в результате гомологичной рекомбинации переходит в область интактной Ti-плазмиды. Отбор клеток А. tumefaciens, несущих рекомбинантные плазмиды, легко осуществим при условии включения в модифицированную ДНК маркирующего гена.

Число трансформированных клеток может быть увеличено за счет использования штаммов А. tumefaciens, обладающих повышенной вирулентностью по отношению к данному виду растений. Тем не менее эффективность агробактериальной трансформации невысока: только 1 из 10 тыс. растительных клеток становится носителем рекомбинантной ДНК [12, 13, 60, 67, 68].

Баллистический способ трансформации генома растений (также называемый микробомбардировкой; методом ускорения частиц; биолистикой — термин, произошедший от объединения слов «биология» и «баллистика») заключается в использовании микробомбардировки интактных растительных клеток золотыми или вольфрамовыми частицами, которые играют роль переносчика рекомбинантной ДНК [24]. В сущности, микрочастицы могут быть из любого химически инертного металла с достаточно высокой молекулярной массой (золото, вольфрам, палладий, родий, платина, индий и др.), чтобы не образовывать металоорганических комплексов с ДНК и обладать достаточно высокой кинетической энергией для эффективной пенетрации клеточной стенки [34, 40, 58, 60].

Частицам размером 1,5–3 микрон, конъюгированным с рекомбинантной ДНК, придается скорость 300–600 м/с посредством электрического разряда или декомпрессии в направлении клеток-мишеней, подлежащих трансформации. Несмотря на то, что эффективность этого метода также весьма низка, биолистика является весьма распространенным способом трансформации однодольных растений [58, 59].

Поскольку многие клетки растений тотипотентны, т.е. способны размножаться, дифференцироваться и образовывать целые плодоносящие растения, получение ГМ-растений из трансформированных клеток не представляет значительных затруднений. Следует подчеркнуть, что процесс трансформации осуществляется в асептических условиях, чтобы исключить заражение бактериями, которое может приводить к ложноположительным результатам при тестировании с помощью ПЦР [9, 12, 63].

Культивирование регенерантов включает несколько серий пассажей на селективных средах. Длительность регенерации трансформированных растений достигает нескольких месяцев, причем все это время растения находятся в среде с высокими концентрациями селективных агентов. Как правило, применяются маркерные гены двух основных типов — селективные и репортерные. Селективные гены придают растениям устойчивость к антибиотикам или гербицидам, репортерные гены детерминируют синтез нейтральных для клеток белков, наличие которых в тканях может быть легко установлено. Селективные гены позволяют трансформированным растениям расти в условиях действия селективных агентов (антибиотиков или гербицидов). Чаще всего используются ген nptII, кодирующий неомицинфосфотрансферазу, инактивирующую антибиотики аминогликозиды (канамицин и др.); ген hptI, кодирующий гигромицинфосфотрансферазу, инактивирующую антибиотик гигромицин; ген bar, кодирующий фосфинотрицинацетилтрансферазу, инактивирующую гербицид глюфосинат (биалафос); ген gox, кодирующий глифосатоксидазу, инактивирующую гербицид глифосат. При получении ГМ-растений, устойчивых к пестицидам, ген устойчивости может выступать как в роли целевого, так и селективного гена. В отличие от селективных, репортерные гены практически не влияют на метаболизм модифицированных растений. Чаще всего в качестве репортерных используются гены β-глюкуронидазы (GUS), зеленого флюоресцентного белка (GPF), люциферазы (LUC), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) и др. [36, 44]. Замена селективных генов на репортерные при отборе ГМ-растений в большинстве случаев весьма желательна, так как негативное влияние на здоровье человека и окружающую среду при использовании репортерных генов практически исключено.

Так или иначе, присутствие маркерных генов, особенно генов устойчивости к антибиотикам, является одним из главных доводов против использования ГМ-продуктов. Поэтому разработан ряд методических подходов, обеспечивающих элиминацию маркерных генов после получения ГМ-растений, когда фактически в них уже нет необходимости. Избирательная элиминация маркерных генов становится возможной благодаря использованию определенных трансформирующих систем, среди которых можно выделить следующие: систему ко-трансформации; систему сайт-специфической рекомбинации; систему внутригеномного перераспределения генов посредством подвижных элементов; применение специфических промотеров маркерных генов; замену оригинального гена соответствующим ему модифицированным геном [66].

В то же время необходимо учитывать, что у растений, подвергаемых сильному стрессу при росте на среде с такими антибиотиками, как канамицин, гигромицин и цефотаксим, ДНК подвергается гиперметилированию [55]. Известно, что метилирование регуляторно-промоторных областей генов высших эукариот, в том числе растений, выключает их экспрессию, т.е. вероятность «замолкания» чужеродных генов в значительной степени возрастает. Таким образом, селекция ГМ-растений на среде с умеренными концентрациями канамицина снижает стрессовую нагрузку и создает условия для их нормального роста и развития [5].

Следующий этап — анализ геномной ДНК растений, направленный на то, чтобы определить присутствие целевого гена и число его копий, интегрированных в геном. Поскольку специфическая модификация растительного генома является результатом рекомбинационного взаимодействия локуса-мишени ДНК растения с клонированным гомологичным (или частично гомологичным) фрагментом чужеродной ДНК, «рекомбинационное поведение» ДНК определяет как качество, так и количество перенесенных молекул ДНК. Анализ геномной ДНК растений может производиться различными путями: детектироваться рестрикционным анализом, Саузерн-блот-анализом, ПЦР-анализом рекомбинировавших ДНК, Нозерн-анализом РНК, оценкой уровня белка по интересующему рекомбинантному гену, использованием сайт-специфических мутантных генов в определенном сочетании, обеспечивающем в случае рекомбинации восстановление нормальной функции гена [6].

Заключительный этап лабораторного тестирования ГМ-растений включает биологические исследования, направленные на подтверждение стабильного фенотипического проявления целевого признака. Необходимость такого рода тестов в значительной степени обоснована многочисленными свидетельствами генетической нестабильности, указывающими, что уровень экспрессии трансгенов в целом непредсказуем и сильно варьирует даже у трансформированных идентичной ДНК-конструкцией клонов, полученных параллельно в одном эксперименте. Показано, что уровень экспрессии зависит от многих факторов, в частности от количества копий трансгенов и сайтов их инсерции. Кроме того, при встраивании в геном конструкция ДНК может быть значительно перестроена (дупликации, инверсии и др.). Оказалось, что экспрессия трансгена, как правило, высока при его попадании в область активного (транскрибируемого) хроматина. Таким образом, чтобы добиться стабильной экспрессии и наследования трансгенов в ГМ-линиях растений, необходимо принимать во внимание следующее: поскольку замолкание генов часто наблюдается после интеграции комплексных вставок, копий с перестройками, дупликациями или делециями, полная единичная инсерция целевого гена обеспечит наибольшую вероятность стабильной экспрессии; степень и длина гомологии чужеродного гена с рецепиентным геномом должны быть минимальны; интеграция копии трансгена наиболее предпочтительна в неметилированную область растительного генома. Так или иначе, обязательный контроль уровня экспрессии трансгена в последующих поколениях абсолютно необходим.

С использованием описанных выше подходов к настоящему времени в мире созданы и доведены до испытаний в полевых условиях ГМ-формы сельскохозяйственных растений, относящиеся более чем к 50 видам. Из них значительную часть представляют агрокультуры, устойчивые к насекомым-вредителям и гербицидам. Придание растениям устойчивости к тем или иным неселективным гербицидам осуществляется либо путем введения генов, кодирующих белки, нечувствительных к данному классу гербицидов (например, к глифосату, хлорсульфуроновым и имидазолиновым гербицидам), либо путем введения генов, детерминирующих ускоренный метаболизм гербицидов в растениях (например, к глюфосинату аммония, далапону) [11].

В настоящее время глифосат является самым широко применяемым гербицидом в мире, в связи с чем представляется обоснованным, что создано значительное количество ГМ-растений, обладающих устойчивостью к этому гербициду [14]. Глифосат (N-(фосфометил) глицин изопропиламинная соль) относится к неселективным гербицидам, механизм действия которого основан на блокировании синтеза некоторых незаменимых ароматических аминокислот, а именно — он влияет на метаболизм шикимовой кислоты. При этом ключевым этапом является процесс синтеза 5-енолпирувилшикимат-3-фосфата из фосфоенолпирувата и шикимат-3-фосфата, катализируемый 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазой. Именно этот фермент и является мишенью действия глифосата. Описанный путь метаболизма шикимовой кислоты характерен для растений, водорослей, бактерий, грибов и простейших одноклеточных; у других живых форм, включая насекомых, рыб, птиц, млекопитающих и человека, такого метаболического пути нет [33, 45, 64]. Для получения культур, устойчивых к глифосату, ген epsps, кодирующий синтез 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазы, модифицируют таким образом, что экспрессируемый на его основе фермент становится невосприимчивым к действию глифосата. В качестве источника гена epsps используется либо ДНК Agrobakterium sp. strain sp4, либо модифицированный собственный ген растения, подвергающегося трансформации [29].

Действующим веществом гербицидов на основе глюфосината аммония является фосфинотрицин, механизм действия которого обусловлен ингибированием фермента глутаминсинтетазы растительных клеток. В растениях глутаминсинтетаза превращает аммиак в глутамин. Блокирование глутаминсинтетазы глюфосинатом приводит к быстрому истощению запаса глутамина в растении, накоплению аммиака в фотосинтезирующих тканях и отравлению растения [16, 26]. Ген устойчивости к глюфосинату принято обозначать pat или bar, в зависимости от того, был он выделен из Streptomyces viridochromogenes или Streptomyces hygroscopicus, вырабатывающих мощный трипептидный антибиотик биалофос. Активной составляющей биалофоса является L-фосфинотрицин [3]. Ген pat/bar кодирует синтез фермента фосфинотрицин ацетилтрансферазы, ацетилирующего свободную NН₂-группу фосфинотрицина. Растения, в которые введен этот ген, обладают способностью продуцировать фосфинотрицин ацетилтрансферазу и, как следствие, устойчивостью к действию глюфосината [26, 27, 53]. Глюфосинат может ингибировать глутаминсинтетазу млекопитающих, однако считается, что он не представляет серьезной опасности, так как не проникает через гематоэнцефалический барьер и быстро удаляется почками [10].

Инсектицидное действие δ-эндотоксинов, образующихся в процессе споруляции грам-положительных почвенных бактерий Bacillus thuringiensis, основано на специфическом связывании с рецепторами клеток кишечного эпителия насекомого, что приводит к нарушению осмотического равновесия, набуханию и лизису клеток [18]. δ-Эндотоксины синтезируются в бактериальной клетке в виде протоксинов, при попадании в кишечник насекомого процессируются, превращаясь из протоксина в активный белок, токсичный для насекомых отрядов чешуекрылых, двукрылых, жесткокрылых. Важно иметь в виду, что для теплокровных животных δ-эндотоксин безвреден [4, 20, 22]. Все описанные гены δ-эндотоксинов объединяются в 5 групп на основании гомологии в аминокислотных последовательностях и инсектицидной активности кодируемых ими белков: от cry1 до cry5. Для получения стойкой экспрессии cry-генов в растениях был разработан подход, суть которого заключалась в использовании синтетических аналогов cry-генов, в которых природные кодоны заменены на оптимизированные для растений [50, 51]. Так, для придания растениям картофеля устойчивости к колорадскому жуку, обычно используют частично модифицированный ген δ-эндотоксина Cry111A из Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis; для получения кукурузы, устойчивой к вредителям, — частично модифицированный ген δ-эндотоксина Cry1A из Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki [56, 65].

Обращает на себя внимание тот факт, что основными разработчиками ГМ сельскохозяйственных культур являются те научные центры, чьи исследования традиционно были направлены на создание химических препаратов для агропромышленного сектора. Проведение параллельных разработок в области биотехнологии и химии приводит к созданию своеобразного тандема: пестицид — растение, имеющее к нему устойчивость. Положительный эффект, достигаемый в результате использования таких комплементарных пар, кроме эффективной борьбы с сорняками и, следовательно, высокой урожайности, включает также значительно более низкое остаточное содержание пестицидов в продукте [35].

В настоящее время интенсивно развивается принципиально новая отрасль животноводства, основанная на применении геномных технологий. Следует отметить, что область генно-инженерных модификаций животных организмов кардинально отличается от генной инженерии растений, которая нашла широкое практическое применение и используется в качестве инструмента современной селекции сельскохозяйственных культур.

Основными целями создания генно-инженерно-модифицированных (ГМ) животных являются получение животных с измененным обменом веществ для увеличения или улучшения качества получаемой от них продукции, животных генетически устойчивых к инфекционным заболеваниям, животных-продуцентов биологически активных рекомбинантных белков, животных-доноров внутренних органов для пересадки человеку (ксенотрансплантация) и животных-моделей для научных целей [1–4].

Если цели генетической модификации лабораторных животных ориентированы главным образом на решение фундаментальных задач, то в определении направлений трансгенеза сельскохозяйственных животных значительную роль играют возможности потенциального развития существующих или создания новых сегментов рынка. По сравнению с лабораторными животными проведение геномной инженерии практически для всех видов сельскохозяйственных животных связано с повышенными трудностями, обусловленными физиологическими особенностями объектов генетической модификации. В этой связи ведется постоянный поиск новых и совершенствование существующих методов трансгенеза в направлении повышения их технической доступности и эффективности.

Важнейшим направлением является получение ГМ-животных с измененным обменом веществ, геном которых содержит гены, продукты экспрессии которых являются регуляторами метаболизма, обеспечивая повышение продуктивности (наращивания мышечной массы, лактации и др.) за счет экономного расхода кормов и изменения качественных характеристик получаемой продукции. Данный подход основан на внедрении в геном животного отдельного гена или группы генов, определяющих конкретный признак, не комбинируя, как при естественном спаривании, с множеством неизвестных и часто нежелательных генов. Предполагалось, что ГМ-технологии позволят получать селекционный эффект по отдельным признакам значительно быстрее, чем при использовании классических методов селекции. Однако уже первые эксперименты, направленные на повышения интенсивности роста животных посредством введения генов, кодирующих белки каскада гормона роста (соматотропин, релизинг-фактор гормона роста), не показали ожидаемый результат. Существенных различий в привесах между ГМ и контрольными животными (овцы, свиньи) не наблюдалось [5]. Кроме того, у ГМ-животных зачастую наблюдались такие проблемы со здоровьем, как вялость, различные аномалии скелета и внутренних органов [6], язва желудка, почечная недостаточность, хромота, воспаление перикарда, уменьшение подвижности суставов, предрасположенность к пневмонии. Возможно, эти патологии связаны с долговременным присутствием в организме избытка гормона роста.

Повышение генетической устойчивости животных к инфекционным заболеваниям является одной из главных задач современного животноводства. Это связано с тем, что инфекционные заболевания постоянно представляют угрозу здоровью животных, заставляя выполнять ряд профилактических мероприятий для предотвращения заражения, приводя к производственным потерям, снижению качества и безопасности продукции животноводства. Кроме того, инфекционные болезни животных могут представлять опасность для здоровья человека (зоонозы). В настоящее время получены последовательности полных геномов многих видов сельскохозяйственных животных [7], однако механизмы генетической устойчивости к заболеваниям остаются не выясненными. Задача защиты животных от инфекций во всем мире решается главным образом методами ветеринарной медицины (вакцины, лекарственные препараты, антибиотики). Искусственная защита животных от инфекций неизбежно создает условия для появления животных с ослабленной иммунной системой. Стратегии создания ГМ-животных, устойчивых к инфекционным заболеваниям, включают разработку двух направлений: введение генов устойчивости в геном хозяина и специфический таргетинг эндогенных или экзогенных генов чувствительности к заболеваниям.

До настоящего времени не было достигнуто каких-либо существенных результатов в направлении повышения устойчивости животных к заболеваниям посредством трансгенеза. Однако экспоненциальный рост экспериментов по секвенированию полных геномов, увеличение плотности SNP-матриц, с одной стороны, и повышение эффективности и технической доступности геномной инженерии животных, с другой стороны, могут стать новым импульсом в развитии данного направления трансгенных технологий в животноводстве.

Развитие исследований по получению ГМ-животных — продуцентов биологически активных рекомбинантных белков (биореакторов) обусловлено необходимостью создания технологических платформ, которые способны эффективно производить рекомбинантные белки, мировая потребность в которых составляет 100 кг/год и более (по данным FDA). Другими движущими факторами развития технологий животных-продуцентов являются, прежде всего, возможности синтеза практически любых белков с проявлением их полной биологической функциональности, достижения существенно более высоких уровней производства рекомбинанных белков по-сравнению с бактериальными и эукариотическими клеточными системами, гибкого регулирования объемов производимой продукции простым изменением численности животных. Наиболее подходящими органами в организме животного являются молочные железы (коровы, козы, овцы) и яйца (куры). Обе эти системы физиологически обладают огромным синтетическим потенциалом. Кроме того, молоко и куриные яйца, содержащие рекомбинантные белки, имеют высокий гигиенический стандарт и могут быть легко получены с использованием имеющихся технологий. Необходимым условием для направленной экспрессии рекомбинантных белков в молочной железе ГМ-животных является использование в генных конструкциях регуляторных элементов генов белков молока: αS1-, αS2-, β- и κ-казеинов, β-лактоглобулина или α-лактальбумина [8]. Анализ результатов многочисленных экспериментов показывает, что даже при использовании одних и тех же регуляторных элементов уровень синтеза рекомбинантных белков между отдельными животными сильно варьирует и зависит главным образом от числа интегрированных копий генной конструкции и места интеграции [2].

Первыми ГМ сельскохозяйственными животными-продуцентами стали овцы, синтезирующие с молоком фактор свертывания крови IX или α₁-антитрипсин под контролем промотора β-лактоглобулина [9]. Первым лекарственным средством, разрешенным к использованию в Европе (2006), а затем и в США (2009), стал препарат «ATryn», действующее вещество которого — антитромбин III человека — получают с молоком трансгенных коз [10]. В настоящее время с молоком трансгенных животных получают более 100 различных белков фармакологического и более 200 белков диагностического назначения, находящихся на различных стадиях исследований, предклинических или клинических испытаний.

Одной из перспективных целей создания животных-биореакторов является синтез биспецифических антител для иммунотерапии опухолей. Биспецифические антитела в отличие от моноклональных (моноспецифических) имеют два специфических участка связывания, один из которых узнает и связывается с клеткой-мишенью (тумор-специфическое антитело), а другой — с рецептором CD28 Т-клеток. В результате такого связывания с рецептором происходит активация Т-клеток и разрушение опухолевой клетки [11]. Таким образом, происходит не только узнавание клеток-мишеней антителами, но и их разрушение за счет мобилизации для этих целей иммунных клеток самого организма. Использование для производства биспецифических антител клеточных систем, которые с успехом применяются для получения моноклональных антител, позволяет добиться лишь незначительного выхода продукта и сопряжено с большими временными затратами при разработке и апробации подходящей клеточной производственной системы. Сейчас ведутся исследования по оптимизации методики очистки рекомбинантного продукта.

Привлекательным источником производства рекомбинантных белков, включая белки со сложной структурой, которые могут синтезироваться только клетками позвоночных, являются яйца кур. Существенные физиологические различия между птицами и млекопитающими представляют определенные преимущества для использования птиц в качестве продукционной платформы. Птицы являются устойчивыми к потенциальным терапевтическим протеинам (например, эритропоэтин человека), экспрессия которых может убивать ГМ-млекопитающих, продуцирующих этот белок. ГМ-птицы делают возможным существенное снижение стоимости и увеличение продуктивной мощности по сравнению с другими методами производства, такими как микробиологическая ферментация E. coli, дрожжи или клетки млекопитающих [12]. Очистка рекомбинантных белков из яичного белка менее сложна, чем из молока, так как белок яйца представляет собой менее сложный биохимический комплекс. Кроме того, присутствие натуральных ингибиторов протеазы в содержимом яйца, а также природное стерильное микроокружение системы яйца обеспечивает идеальную среду с точки зрения стабилизации биологической активности чужеродных белков [13]. По сравнению с млекопитающими паттерн гликозилирования некоторых белков птицы сходен с аналогичными белками человека [14].

На сегодняшний день с использованием конститутивных и тканеспецифических промоторов получены трансгенные птицы, экспрессирующие репортерные гены LacZ [15] и GFP [16, 17], бактериальный ген β-лактамазы [18], интерферон человека α2b [13], β-интерферон человека [19], гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека [20], моноклональные антитела [21], антагонист рецептора β-интерлейкина [20] и гормон роста человека [22].

Создание животных-доноров внутренних органов рассматривается в качестве одного из перспективных путей решения проблемы нехватки внутренних органов и тканей для пересадки человеку (ксенотрансплантация). Наиболее подходящим видом животных для этой цели являются свиньи [23]. Однако до последнего времени использование свиней в качестве доноров рассматривалось только теоретически, так как пересадка их органов и тканей приматам сопровождалась отторжением в течение нескольких дней или даже часов после трансплантации (сверхострая реакция отторжения). Решением проблемы снятия такой реакции отторжения может стать создание GAL-KO трансгенных свиней с нокаутом гена GGTA1. Впервые о создании GAL-KO свиней сообщили две лаборатории в США, одна из которых получила линию на основе обычных домашних свиней [24, 25], а вторая — на основе минипигов [26, 27]. В настоящее время обе линии активно используются в различных доклинических исследованиях, а также в качестве доноров клеток для проведения дополнительных генетических манипуляций. Принимая во внимание перспективы использования GAL-KO трансгенных свиней в трансплантационной медицине и разработку более совершенных методов нокаута генов млекопитающих, по крайней мере, 6 исследовательских групп во всем мире сообщили о создании таких свиней [28].

Дальнейший прогресс в использовании свиней в качестве доноров для ксенотрансплантации связывают с проведением дополнительных манипуляций (в частности, с экспрессией у GAL-KO свиней белков-регуляторов комплемента человека, таких как CD46, CD55 и CD59) [29]. Достижение поставленных целей требует проведения новых широкомасштабных исследований, но достигнутые успехи в нокауте GGTA1 позволяют уже сегодня говорить о потенциальной значимости GAL-KO свиней в решении некоторых задач трансплантационной медицины. В частности, рассматривается возможность их использования в качестве источника кожи в терапии ожоговых ран и как доноров сердечных клапанов [28].

Крупные сельскохозяйственные животные (в частности, свиньи и овцы) играют все возрастающую роль в трансляционных биомедицинских исследованиях в качестве животных-моделей. Генетическая модификация свиней позволяет создавать животных, моделируя у них механизмы болезней человека на молекулярном уровне [30]. В настоящее время уже получены свиньи-модели для изучения цистического фиброза [31, 32], диабета [33] и дистрофии макулярной области сетчатки Штаргардта [34]. Эти модели вызывают огромный интерес у профильного научного сообщества. Также созданы ГМ-свиньи с индуцированной экспрессией трансгенов, основанной на бинарной tet-on-системе. Экспрессионная система активируется доксициклином через tet-контролируемый трансактиватор. Связывание трансактиватора с ответным элементом трансактиватора (TRE) приводит к транскрипции downstream-генов [35]. Такие свиньи рассматриваются в качестве идеальных моделей для экспериментальной физиологии и трансляционной медицины.

Таким образом, направления использования ГМ-животных четко определены и ведется работа по созданию новых и совершенствованию существующих методов. Для трансформации генома животных в настоящее время используют следующие методы:

– метод микроинъекции;

– метод пересадки ядер соматических клеток;

– метод, основанный на использовании ретровирусных и лентивирусных векторов;

– метод, основанный на использовании спермиев в качестве переносчиков ДНК;

– метод активного трансгенеза.

Метод микроинъекции, первоначально разработанный для получения ГМ-мышей [36, 37], стал первым приемом, успешно примененным для создания ГМ сельскохозяйственных животных [38, 39]. Суть метода заключается во введении раствора генных конструкций в форме линейных молекул ДНК в мужской пронуклеус зигот [8]. По завершении микроинъекции эмбрионы культивируют несколько часов и пересаживают в яйцевод синхронизированных реципиентов. Несмотря на достигнутые в этой области трансгенеза успехи, эффективность (число полученных ГМ-животных от числа пересаженных эмбрионов) классического метода микроинъекции остается очень низкой и варьирует от 0,5 до 2%.

Метод микроинъекции в пронуклеус оставался доминирующим в создании трансгенных сельскохозяйственных животных до середины 1990-х гг. и был практически полностью вытеснен методом пересадки ядер соматических клеток, генетически трансформированных in vitro. В последние годы благодаря достижениям в развитии сайт-специфических эндонуклеаз метод микроинъекции в зиготы с некоторыми модификациями получает свое новое развитие.

Пересадка ядер соматических клеток (Somatic cell nuclear transfer, SCNT), генетически трансформированных in vitro, является сегодня наиболее часто используемым способом получения ГМ сельскохозяйственных животных. Возможность получения жизнеспособного потомства посредством SCNT, культивируемых in vitro, впервые была продемонстрирована на овцах с использованием в качестве доноров ядер клеток молочной железы [40]. Несколько позже та же группа сообщила о получении трансгенных овец посредством пересадки ядер стабильно трансформированных первичных фетальных (эмбриональных) фибробластов [41]. Эффективность трансгенеза составляла 100%, в то время как применение метода микроинъекции в той же лаборатории позволяло получать лишь 4,35% трансгенных потомков от числа родившихся животных. Генетически трансформированные фетальные фибробласты и сегодня остаются наиболее часто используемым типом клеток для получения ГМ сельскохозяйственных животных. Преимуществом метода является возможность тестирования интеграции, а в ряде случаев и экспрессии трансгена в культуре клеток. Это означает, что все эмбрионы, полученные после пересадки ядер, будут трансгенными. Используемые клеточные линии могут быть кариотипированы в культуре, что позволяет заранее предопределять пол ГМ-животных. Другим преимуществом метода SCNT является возможность целенаправленного воздействия на геном посредством генного таргетинга [42].

Новую эпоху в области трансгенеза животных связывают с применением для геномной инженерии млекопитающих системы CRISPR/Cas9, включающей короткие палиндромные повторы (CRISPR), расположенные группами, равномерно удаленными друг от друга, и CAS9-нуклеазы (CRISPR-ассоциированные нуклеазы) [62, 63]. Узнавание целевого участка ДНК в системе CRISPR/Cas9 основано на использовании малых некодирующих направляющих РНК, которые комплементарно взаимодействуют с мишенью, маркируя тем самым специфический участок чужеродной ДНК для последующего разрезания нуклеазой [64]. Благодаря своей высокой эффективности, а также простоте и малой трудоемкости, технология находит все более широкое применение. Кроме того, она может быть использована для одноступенчатой генерации мутаций в нескольких генах одновременно [65], что невозможно ни одним из ранее используемых методов.

С высокой долей уверенности можно утверждать, что технология CRISPR/Cas9 в ближайшее время станет доминирующей в создании ГМ сельскохозяйственных животных. Принимая во внимание, что клонирование с использованием пересадки ядер соматических клеток (SCNT) является тривиальной процедурой в целом ряде лабораторий во всем мире, в том числе и в России [66], в ближайшее время можно прогнозировать экспоненциальный рост получения трансгенных сельскохозяйственных животных с использованием технологии CRISPR/Cas9.

Наряду с созданием ГМ сельскохозяйственных животных — млекопитающих (коров, коз, овец, свиней, кроликов), не меньший интерес представляет создание генетически модифицированных кур. Однако трудности в точности определения овуляции, большое количество желтка в яйцеклетке, сильное уплотнение цитоплазмы около пронуклеусов не позволяют использовать для трансгенеза этого вида животных классический метод микроинъекции [67]. Эффективным способом создания трансгенных кур является трансформация бластодермальных клеток на стадии Х с использованием лентивирусных и ретровирусных векторов [68]. Как перспективное в последние годы рассматривается также направление трансгенеза птиц, связанное с использованием в качестве клеток-мишеней примордиальных зародышевых клеток [69, 70, 71]. Данные клетки являются предшественниками половых клеток, что позволяет проводить целенаправленную генетическую модификацию гонад, повышая тем самым эффективность получения трансгенного потомства.

Таким образом, технологии генетических модификаций животных находят все большее применение для решения задач фундаментальной и прикладной науки. Лимитирующим фактором массового создания ГМ сельскохозяйственных животных до недавнего времени оставались высокие материальные затраты, обусловленные главным образом относительно низкой эффективностью трансгенеза. Принимая во внимание решение данной проблемы за счет развития технологий сайт-специфических нуклеаз, можно прогнозировать рост числа исследований в области геномной инженерии животных.

Отдельным направлением исследований в этой области является создание ГМ-рыб. До настояще­го времени модификацию генома рыб производили с помощью микроинъекций ДНК или электропораций оплодотворенных яйцеклеток различных видов рыб — карпа, зу­батки, форели, лосося и т.д. Поскольку у рыб пронуклеус в оплодотворенной яйцеклетке пло­хо различим в обычный микроскоп, линеаризованную рекомбинантную ДНК вводят в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток или клеток эмбрионов, достигших стадии четырех бластомеров. Эмбриогенез у рыб протекает в водной среде вне организма, поэтому в имплантации нет необхо­димости. Все дальнейшие процессы могут протекать в резервуарах с регулируемой температурой. Выживаемость эмбрионов рыб после микроинъекций сравнительно высока (от 35 до 80%), а доля ГМ-потомков колеблется от 10 до 70%. Рекомбинантную ДНК можно обнаружить с помощью ПЦР с использованием либо препаратов эритроцитов зародышей, либо суммарной ДНК. Большинство первых исследований в этой области было направлено на исследование влияния гормона роста на скорость роста. Так, в одном из экспериментов в яйцеклетки атлантического лосося была введена рекомбинантная ДНК, содержащая следующие элементы: промотор гена антифризного белка американской бельдюги, кДНК гормона роста лосося, сигналов терминации/полиаденилирования 3'-конца гена антифризного белка американской бельдюги.

В настоящее время ГМ-лосось «AquAdvantage», разработанный американской компанией «AquaBounty Technologies» и характеризующийся быстрым ростом (достигает размеров взрослой рыбы за 1,8 года, тогда как традиционный лосось достигает этих размеров за 3 года), одобрен FDA. В РФ в рамках выполнения межгосударственных программ «Белространсген» и «Белространсген-2» были созданы ГМ-козы, продуцирующие в молоке лекарственный белок — лактоферрин человека, однако этот проект был реализован лишь до стадии лабораторных прототипов.

Таким образом, принимая во внимание интенсивное развитие исследований в области генной инженерии, в настоящее время существует необходимость совершенствование системы оценки безопасности и методов контроля за ГМО в РФ.

Мировое производство и перспективы развития

Научные достижения в области молекулярной биологии и генетической инженерии позволили создать новые методы селекционной работы, основанной на направленной модификации генома растений. За период с 1996 по 2016 г. мировые площади посевов ГМ-культур возросли более чем в 100 раз, достигнув 179,7 млн га (рис. 31.1). В 2015 г. ГМ-культуры выращивали 28 стран, в том числе 5 стран Евросоюза (Испания, Португалия, Чешская Республика, Словакия, Румыния) выращивали ГМ-кукурузу на площади более 116 тыс. га.

Рис. 31.1. Площади, занятые генно-модифицированными культурами (всего в мире)

По данным International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA), в 2015 г. основной ГМ-культурой оставалась соя, занимавшая 49% (81,0 млн га) от всей площади возделывания ГМО, на втором месте — кукуруза 32% (52,0 млн га), далее хлопок — 13,5%, (22,0 млн га) и рапс — 5,5% (9,0 млн га) [63].

Общие площади посевов сои в мире составляют ~100 млн га, кукурузы — 159 млн га, хлопка — 30 млн га, рапса — 31 млн га. Таким образом, в 2012 г. посевы ГМ-сои занимали 81% от общей площади, занятой соей, посевы ГМ-кукурузы, хлопка и рапса — 35, 81 и 30%, соответственно (рис. 31.2).

Рис. 31.2. Площади, занятые основными генно-модицицированными культурами (данные за 2012 г.)

Наиболее интенсивно в сельском хозяйстве используются культуры с генетической модификацией, определяющей устойчивость к гербицидам: в 2015 г. растения с этими свойствами занимали 60,2%, ~100 млн га от общей площади посевов ГМО; растения с комбинированными признаками — «селекционные стекеры», содержащие два и более трансформационных событий, в 2015 г. занимали 2-е место — 24,7%, ~41 млн га; Bt-культуры, устойчивые к вредителям, в 2012 г. занимали 3-е место — 15,1%, ~25 млн га [63].

К настоящему времени в мире зарегистрированы и допущены к промышленному производству пищи и кормов более 360 линий ГМ-культур [5]. Из них 120 линий зарегистрированы в США — в соответствии с базой данных Управления по пищевым продуктам и лекарственным препаратам при правительстве США (Food and Drug Administration) [4], 62 линии зарегистрированы в Евросоюзе — в соответствии с базой данных gmo-compass [3].

В РФ (по ситуации на февраль 2017 г.) разрешено использование в питании населения 23 линий ГМО (9 линий сои, 12 линий кукурузы, 1 линия риса, 1 линия сахарной свеклы); использование при производстве кормов — 16 линий ГМО (6 линий сои, 10 линий кукурузы). Сельскохозяйственное выращивание ГМО в России запрещено (в соответствии с требованиями Федерального закона от 3 июля 2016 г. № 358-ФЗ «О внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации в части совершенствования государственного регулирования в области генно-инженерной деятельности»).

Принципы оценки безопасности

Практическое применение новых способов трансформации генома растений повлекло за собой потребность в строгой регламентации процесса оценки безопасности ГМО растительного происхождения, предназначенных для использования в пищу. Разработка системы оценки безопасности ГМО, действующей в настоящее время в РФ была начата в 1995–1996 гг. Данная система не только аккумулирует весь отечественный и зарубежный опыт, но и включает новейшие научные подходы, основанные на достижениях современной фундаментальной науки: геномный и протеомный анализ, выявление повреждений ДНК и мутагенной активности, выявление продуктов свободнорадикальной модификации ДНК и других чувствительных биомаркеров [10, 42, 57, 58, 92, 98, 124, 125, 141].

Оценка безопасности ГМО проводится на этапе государственной регистрации. Государственной регистрации подлежат новые пищевые продукты, полученные из ГМО растительного происхождения, изготовленные в РФ, а также пищевые продукты, полученные из ГМО растительного происхождения, ввоз которых на территорию РФ осуществляется впервые [11, 25]. В системе медико-биологических исследований безопасности ГМО, наряду с общетоксикологическими исследованиями, важное место принадлежит изучению специфических видов токсичности в экспериментах in vivo. В соответствии со сложившейся исследовательской практикой используется комплексный подход, предоставляющий наиболее полную и достоверную информацию о потенциальном генотоксическом, иммунотоксическом и аллергенном действии ГМО, а также позволяющий выявить возможные незаданные эффекты генетической модификации [10, 15, 26, 27, 33]. При необходимости, в случае выявления существенных изменений генома, протеома и метаболома ГМО, могут быть проведены дополнительные исследования (влияние на репродуктивную функцию, гонадотоксическое, эмбриотоксическое, тератогенное действие; влияние на продолжительность жизни и др.) [25].

Методы оценки риска, применяемые в разных странах для оценки и наблюдения пищевых продуктов и кормов, полученных из ГМО растительного происхождения, основаны на общих принципах, сформированных в результате накопления опыта и научных знаний в течение последних десятилетий. Эти принципы впервые были предложены в 1993 г. (ОЭСР, 1993) и более подробно рассмотрены и детализированы на заседании специальной межправительственной рабочей группы, в состав которой входили представители комиссии «Кодекс Алиментариус», представители Продовольственной и сельскохозяйственной организации объединенных наций (FAO) и представители Всемирной организации здравоохранения (WHO) (2003). Данная рабочая группа была создана в 1999 г. для разработки стандартов, методических указаний и рекомендаций по оценке пищи, полученной с использованием современных биотехнологий. Были разработаны 3 документа, принятые комиссией «Кодекс Алиментариус» в 2003 г.: «Принципы оценки риска пищи, полученной с использованием современных биотехнологий» — рамочный документ, обобщающий основные принципы оценки риска использования ГМ-пищи (использование традиционного аналога в качестве эталонной модели, использование интегрированного подхода, позволяющего дифференцировать заданные и незаданные эффекты модификации генома растения, выявить возможные риски для здоровья человека); «Руководство по оценке безопасности пищи, полученной из растений, содержащих рекомбинантную ДНК» и «Руководство по оценке безопасности пищи, полученной из микроорганизмов, содержащих рекомбинантную ДНК» детализирующие основные принципы оценки риска, изложенные в предыдущем документе. Согласно «Руководству по оценке безопасности пищи, полученной из растений, содержащих рекомбинантную ДНК», для оценки безопасности необходимы следующие данные:

– описание растения, содержащего рекомбинантную ДНК;

– описание родительского растения и истории его использования в пищу;

– описание организма-донора внесенных генов;

– описание способа генетической модификации;

– характеристика структуры и свойств трансформационного события;

– оценка безопасности (включает оценку безопасности нового белка, экспрессируемого на основе рекомбинантной ДНК; оценку эквивалентности химического состава ГМО и его традиционного аналога по основным компонентам — содержанию белка, жира, углеводов; оценку метаболитов; влияние технологической переработки; оценку изменения пищевой ценности) и пр. [1–8].

Данный подход к оценке безопасности ГМО лег в основу национальных систем, действующих в разных странах в настоящее время. Ниже приведены основные характеристики систем оценки безопасности ГМО, применяющихся в Евросоюзе, США, Канаде, Австралии и РФ.

Европейский Союз

Регулирование использования ГМО в Евросоюзе обеспечивают два основных законодательных акта (табл. 31.1):

• Директива о преднамеренном выпуске генетически модифицированных организмов в окружающую среду (2001/18) [237];
• Регламент о генетически модифицированной пище и кормах (1829/2003) [238].

Таблица 31.1. Сравнительная характеристика Директивы (2001/18) и Регламента (1829/2003)*

Основные характеристики	Директива (2001/18) [237]	Регламент (1829/2003) [238]
Сфера действия	Выпуск в окружающую среду ГМО в коммерческих или иных целях	Пища и корма, полученные из ГМО или содержащие ГМО
Требования безопасности	Отсутствие негативного действия ГМО на здоровье человека или окружающую среду	Отсутствие негативного действия ГМО на здоровье человека и животных или окружающую среду. Запрещено введение в заблуждение потребителей (пользователей)
Процедура регистрации	1. Предоставление заявки и комплекта документов (включающего доказательства соответствия ГМО требованиям Директивы (2001/18) в уполномоченный орган государства — члена ЕС, рассмотрение представленных документов на национальном уровне. 2. В случае положительного решения о регистрации ГМО, национальный уполномоченный орган информирует другие государства — члены ЕС и Европейскую комиссию. Если в течение 105-дневного периода не было выдвинуто возражений и дополнительных вопросов со стороны государств ЕС или комиссии, государство-заявитель регистрирует ГМО; регистрация действительна на всей территории ЕС. 3. В случае возникновения разногласий оценка безопасности ГМО проводится в соответствии с программой, рекомендованной EFSA	1. Предоставление заявки и комплекта документов (включающего доказательства соответствия ГМО требованиям Регламента (1829/2003) в уполномоченный орган государства — члена ЕС. 2. Передача документов в EFSA, другие государства ЕС и Европейскую комиссию. 3. Оценка безопасности ГМО в соответствии с программой, рекомендованной EFSA
	4. Подготовка проекта решения Европейской комиссии о регистрации ГМО с учетом рекомендаций EFSA. 5. Голосование на заседании комитета по пищевой безопасности [«Standing Committee for Food Chain and Food Safety» (Member States)] по принятию проекта решения Европейской комиссии. Проект решения может быть принят или отклонен большинством голосов. 6. В случае если голосование на заседании комитета по пищевой безопасности признано несостоявшимся, повторное голосование проводится на заседании Совета министров
Действие регистрации	10 лет	10 лет

Примечание. * по [10].

Директива (2001/18) регулирует отношения, возникающие при преднамеренном выпуске в окружающую среду ГМО в коммерческих или иных целях. В соответствии с требованиями Директивы (2001/18) преднамеренный выпуск ГМО в окружающую среду можно осуществлять, руководствуясь принципом предосторожности, т.е. при гарантированном отсутствии негативного действия ГМО на здоровье человека или окружающую среду.

В соответствии с Регламентом (1829/2003) ГМ-пища или корма могут быть допущены на рынок ЕС только после проведения оценки риска для здоровья человека или животных и, в случае необходимости, оценки риска негативного воздействия на окружающую среду. Согласно требованиям Регламента (1829/2003) ГМ-пища или корма не должны оказывать неблагоприятное воздействие на здоровье человека и животных, окружающую среду; вводить в заблуждение потребителей (пользователей); отличаться от пищи или кормов, полученных из традиционных источников, для которых данные ГМ-пища или корма будут являться равноценным аналогом (в условиях обычного использования пищи/кормов). Кроме того, ГМ-корм не должен оказывать негативного влияния на качество продуктов животноводства.

Таким образом, в Евросоюзе существует два пути регистрации ГМО:

– регистрация с целью выпуска в окружающую среду в коммерческих или иных целях;

– регистрация пищи и кормов, полученных из ГМО или содержащих ГМО [8–11].

Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов (European Food Safety Authority, EFSA) предоставляет независимые научные консультации и информацию по существующим и возможным рискам, связанным с пищей, тогда как принятие решений в отношении регистрации продукции, а также контрольные мероприятия находятся в зоне ответственности соответствующих авторизованных органов стран ЕС и Европейской комиссии. Научной секцией EFSA по ГМО было разработано руководство по оценке риска ГМО, полученных из растений, которое помогает заявителям собрать весь необходимый объем данных для регистрации новых ГМО.

Для регистрации ГМО растительного происхождения в Евросоюзе заявитель должен представить следующую информацию [10]:

– о родительском организме;

– о генетической модификации;

– о генетически модифицированном растении.

Информация о родительском организме включает таксономическую характеристику, описание способа размножения и распространения; данные о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах.

Информация о генетической модификации включает описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки; описание организма(ов)-донора(ов) вносимых генов — таксономическая характеристика, история использования.

Информация о генетически модифицированном растении включает описание свойств, приобретенных растением в результате модификации, описание структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристику экспрессии встроенных генов (экспрессия в процессе онтогенеза растения, интенсивность экспрессии в структурных компонентах растения и др.), характеристику различий с родительским организмом (способ размножения, способность к перекрестному опылению, устойчивость к стрессовым воздействиям и др.), характеристику генетической и фенотипической стабильности (должны быть представлены данные, полученные в результате исследований нескольких поколений ГМ-растений), характеристику способности к переносу генов в другие организмы (растения, микроорганизмы).

Информация о возможности токсического, аллергенного и другого неблагоприятного воздействия на человека и животных включает результаты комплексных исследований безопасности данного ГМО.

В соответствии с требованиями European Food Safety Authority (EFSA) [5, 10] исходным пунктом оценки безопасности является сравнение химического состава ГМ-продукта с химическим составом его традиционного аналога (наиболее сходного с ним по составу и свойствам пищевого продукта). В число определяемых параметров входят ключевые макро- и микронутриенты, антиалиментарные факторы, токсины и аллергены, причем набор исследуемых показателей должен быть установлен для каждого конкретного случая индивидуально, в зависимости от состава и свойств изучаемого продукта. Если в процессе сравнительного анализа химического состава ГМО и его традиционного аналога обнаружены отличия, выходящие за пределы физиологических колебаний, характерных для данного показателя у данного вида растений, должны быть проведены расширенные исследования метаболизма ГМО с целью установления причины выявленных изменений.

Поскольку незаданные эффекты генетической модификации могут проявляться не только в изменении содержания ключевых нутриентов, но и в изменении агрономических свойств ГМ-растений, таких как морфология, время цветения и плодоношения, чувствительность к воздействию абиотических и биотических факторов, должны быть проведены сравнительные исследования агрономических характеристик ГМО и его традиционного аналога. Кроме того, должно быть изучено влияние технологической обработки ГМ-сырья растительного происхождения на свойства конечного продукта в сравнении с традиционным аналогом изучаемого ГМО. В рамках изучения действия технологической обработки на свойства ГМО должны быть проведены исследования, направленные на выявление функциональных участков рекомбинантной ДНК в пищевом продукте, с целью оценки потенциального риска, связанного с горизонтальным переносом генов в геном человека, животных или окружающую среду. Также должен быть изучен характер влияния технологической обработки на белок, определяющий проявление заданного признака у ГМО: происходит ли повышение концентрации или элиминация, денатурация или деградация.

Токсикологические исследования ГМО можно условно разделить на 2 основных раздела, первый из которых включает оценку безопасности белка, определяющего проявление заданного признака у ГМО, второй — оценку безопасности нативного продукта [10].

Оценка безопасности белка включает:

– молекулярную и биохимическую характеристику белка (первичная структура, молекулярный вес, посттрансляционные модификации, функция). В случае если данный белок является ферментом, необходимы данные о его ферментативной активности, оптимальной температуре и рН, субстратной специфичности, продуктах реакции;

– поиск гомологии с токсинами белковой природы, а также с белками, обладающими фармакологической или иной биологической активностью (при использовании баз данных PIR, EMBL, SwissProt, GenBank и др.);

– изучение стабильности белка при обработке, хранении, технологической переработке; влияние температуры и рН, возможные модификации (например, денатурация) и/или образование стабильных белковых фрагментов в результате различных воздействий;

– изучение устойчивости белка к обработке протеолитическими ферментами (например, пепсин) в эксперименте in vitro. Стабильные продукты распада белка, образовавшиеся после обработки ферментами, должны быть охарактеризованы с учетом их биологической активности;

– проведение токсикологических исследований, если сведения о белке недостаточны или есть информация о возможном неблагоприятном действии данного белка;

– токсикологические исследования, которые проводятся до тех пор, пока не будет получена достоверная информация о безопасности белка, его свойствах, а также об отсутствии структурной и функциональной гомологии с белками, способными оказывать воздействие на здоровье человека или животных;

– исследования пероральной токсичности белка в 28-дневном эксперименте на грызунах (в соответствии с OECD guideline 407) [12]. В зависимости от результатов эксперимента могут быть проведены дополнительные исследования (иммунотоксикологические и др.).

Поскольку для проведения запланированных исследований требуются значительные количества белка, для его получения обычно используют микроорганизмы. Идентичность исследуемого белка и белка, синтезированного микроорганизмами, должна быть подтверждена сравнением молекулярного веса, изоэлектрических точек, аминокислотных последовательностей, посттрансляционных модификаций, иммунологической реактивности, ферментативной активности (если белок является ферментом) и др.

Оценка безопасности нативного продукта должна быть проведена в случае, если химический состав ГМО изменен в значительной степени или если есть доказательства вероятности проявления незаданных эффектов генетической модификации (полученные при проведении молекулярного анализа, исследований химического состава и фенотипических свойств).

Оценка безопасности нативного продукта включает:

– эксперимент на грызунах длительностью не менее 90 дней. Животные должны получать исследуемый продукт и его традиционный аналог как минимум в двух дозах — максимально возможной при соблюдении оптимального баланса пищевых веществ и приближенной к среднему уровню потребления человеком. В течение эксперимента ведутся наблюдения за поедаемостью корма, массой тела и общим состоянием животных. По завершении эксперимента проводится изучение гематологических показателей, биохимический анализ крови и мочи, морфологические исследования внутренних органов;

– дополнительные исследования на молодых быстро растущих животных (цыплятах-бройлерах, ягнятах и др.). Отклонение от нормальных значений прироста массы тела можно рассматривать как интегральный показатель неблагоприятных воздействий на организм, являющихся результатом проявления незаданных эффектов генетической модификации.

Исследования аллергенности ГМО так же, как и токсикологические исследования, подразделяются на 2 основных блока: оценку аллергенных свойств белка, определяющего проявление заданного признака у ГМО, и оценку аллергенных свойств нативного продукта [10].

Оценка аллергенных свойств белка включает последовательное проведение следующих тестов:

– сравнение с известными аллергенами (с использованием баз данных, содержащих информацию о трехмерной структуре и функции известных аллергенов и родственных им белков);

– определение потенциальной аллергенности белка в иммунохимических исследованиях in vitro с использованием IgE, выделенных из сыворотки крови пациентов, страдающих аллергией;

– определение устойчивости к воздействию протеолитических ферментов (пепсина). Несмотря на отсутствие абсолютной корреляции между устойчивостью белка к воздействию протеолитических ферментов и его аллергенными свойствами [13], тест на устойчивость к расщеплению протеазами пищеварительного тракта млекопитающих можно считать дополнительным критерием, позволяющим выявить белковые аллергены;

– скрининговые исследования с использованием сывороток крови пациентов, страдающих аллергией;

– дополнительные исследования (в том числе in vivo) [10].

Аллергологические исследования нативного продукта должны быть проведены в случае, если имеются данные об аллергенных свойствах организма-донора.

Оценка аллергенных свойств нативного продукта включает:

– сравнение набора аллергенов исследуемого ГМО с набором аллергенов его традиционного аналога;

– применение новейших методов диагностики (профильные технологии), позволяющих выявить присутствие новых аллергенов [10, 14, 15].

Согласно современным представлениям использование профильных технологий, а именно — транскриптомики, протеомики и метаболомики, при оценке безопасности ГМО позволит значительно повысить чувствительность и специфичность проводимых исследований, особенно в части выявления незаданных эффектов генетической модификации. Вместе с тем применение профильного анализа не ставит своей целью вытеснить подходы к оценке безопасности, построенные на сравнительной оценке ГМО и его традиционного аналога, его использование направлено на получение дополнительных и достоверных доказательств безопасности ГМО для здоровья людей и животных.

В соответствии с требованиями EFSA [10] исследования ГМО также должны включать:

– оценку пищевой ценности (так как заданные и незаданные эффекты генетической модификации могут являться причиной изменения баланса макро- и микронутриентов и, следовательно, вести к изменению пищевой ценности продукта);

– постмаркетинговый мониторинг (проводится с целью выявления незаданных эффектов генетической модификации, которые не могли быть обнаружены на стадии дорегистрационных исследований);

– ряд исследований, направленных на изучение взаимодействия ГМО с биотическими и абиотическими факторами окружающей среды (таких, как изучение механизма взаимодействия ГМ-растения с целевыми организмами, изменение взаимодействия с которыми является заданным эффектом генетической модификации; изучение потенциальной возможности к передаче генов; влияние на биогеохимические процессы и др.).

Рассмотрение всех полученных данных, включающих также оценку роли изучаемого ГМО в рационе питания и определение ожидаемого уровня и частоты потребления, позволяет провести расчет рисков для популяции и ее отдельных подгрупп, сравнение рисков с допустимыми уровнями, т.е. провести анализ риска для здоровья людей и/или животных.

США

В США за безопасность пищи отвечает Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA), однако официально ГМ-пища не регулируется, поэтому процесс регистрации, если ГМ-пища по своему компонентному составу полностью соответствует традиционному аналогу (т.е. не было целенаправленного изменения состава продукта), проходит как добровольная консультация. Производители ГМО в США могут и не проходить консультации в FDA, однако в соответствии с установившейся практикой они предпочитают завершить процесс консультаций еще до выхода нового ГМО на рынок. Заявитель подает досье, включающее следующую информацию [16]:

– название новой ГМ-линии, таксономическая характеристика растения;

– описание областей применения нового ГМО для пищевых целей, возможность использования при производстве кормов;

– информация об источнике, отличительных чертах и функции внесенных генов;

– информация о целях модификации генома, технических свойствах модифицированного растения, их ожидаемое влияние на содержание основных нутриентов в пище или кормах, полученных из данного ГМ-растения;

– информация об отличительных характеристиках и функции белков, экспрессируемых рекомбинантной ДНК, включая их количественное содержание как непосредственно в различных частях ГМ-растения, так и в пище, подвергнутой технологической обработке;

– информация о возможном или предполагаемом токсическом и аллергенном действии белков, экспрессируемых рекомбинантной ДНК, и основания для заключения о безопасности потребления этих белков в составе пищи или корма;

– сравнение композиционного состава ГМО и его традиционного аналога (по основным макро- и микронутриентам, антиалиментарным факторам, токсинам и т.п.);

– информация о возможном аллергенном действии ГМО (влияние модификации на аллергенный потенциал);

– прочая информация, относящаяся к безопасности и пищевой ценности ГМ-пищи.

По результатам проведенных консультаций заявитель получает письмо от FDA, в котором говорится, что агентство рассмотрело досье и согласно с выводами заявителя о безопасности растений и продуктов, получаемых из них, для использования в питании человека.

В случае если модификация растения направлена на придание ему инсектицидных свойств, пестицидный белок, экспрессируемый на основе рекомбинантной ДНК, регулируется аналогично традиционным пестицидам, за его безопасность отвечает Агентство по охране окружающей среды США (Environmental Protection Agency, EPA). EPA устанавливает МДУ данного пестицида в пище, в 14-дневном эксперименте на мышах проводятся исследования острой пероральной токсичности (ведутся наблюдения за динамикой массы тела, массой внутренних органов, смертностью, а также макро- и микроскопические исследования внутренних органов). Кроме того, должен быть проведен поиск гомологии пестицидного белка с токсинами и аллергенами белковой природы, а также с белками, обладающими фармакологической или иной биологической активностью (с использованием соответствующих баз данных); изучена стабильность белка при обработке протеолитическими ферментами желудочно-кишечного тракта, а также при действии высокой температуры. EPA также требует информацию о плазмидной конструкции, использованной для модификации растения, источнике генетических структур, использованных в плазмиде, информацию о процессе трансформации, количестве вставок, стабильности и наследуемости признака, последовательности ДНК в области встраивания, уровне экспрессии пестицидного белка в разных тканях ГМ-растения, возможности перекрестного скрещивания с родственными видами. Также необходима информация о возможном влиянии на окружающую среду (в качестве целевых организмов рассматриваются птицы, рыбы, водные беспозвоночные, насекомые, пресноводные и морские животные). Пестицидный белок может быть зарегистрирован EPA только после полевых испытаний ГМ-растения на общей площади не менее 4 га [16].

Служба контроля здоровья животных и растений (Animal and Plant Health Inspection Service, APHIS) Департамента сельского хозяйства США также участвует в регулировании использования ГМ-растений. Согласно Постановлению о защите растений (Plant protection act) APHIS отвечает за защиту сельского хозяйства от вредителей и болезней, следовательно, APHIS регулирует использование организмов или продуктов, которые потенциально могут иметь вредное действие на другие растения, в том числе возникшее в результате генетической модификации. В зоне ответственности APHIS находятся импорт, обращение, перемещение внутри штата, выпуск ГМО в окружающую среду, в том числе для экспериментальных исследований и полевых испытаний. Заявитель представляет в APHIS прошение о придании ГМО нерегулируемого статуса, сопровождаемое данными о биологии растения-рецепиента (экспериментальные данные и данные публикаций), генотипическое и фенотипическое описание модифицированного организма, данные полевых испытаний. APHIS оценивает варианты возможного риска использования ГМО для различных насекомых; чувствительность к болезням и насекомым; экспрессию новых продуктов, ферментов; изменения метаболизма растения; потенциал для перерождения в сорняк; возможность передачи признака диким растениям; особенности сельскохозяйственного выращивания; влияние на нецелевые организмы; потенциал для передачи генов в другие организмы. Файл с этими данными публикуется в on-line-версии федерального регистра США для последующего публичного обсуждения. Принятие решения об удовлетворении прошения основано на основании оценки всех представленных данных и результатов публичного обсуждения. Если прошение удовлетворено, то данный ГМО больше не рассматривается как «регулируемый объект» и выходит из зоны ответственности APHIS [16].

Канада

В Канаде ответственность за регулирование качества и безопасности пищевых продуктов, в том числе новых источников пищи, поступающих на продовольственных рынок, разделена между Министерством здравоохранения (Health Canada) и Агентством по контролю за качеством пищевых продуктов (Canadian Food Inspection Agency, CFIA). Министерство здравоохранения отвечает за формирование стандартов и политики управления в области безопасности и пищевой ценности, а также за развитие новых требований к маркировке пищевых продуктов, что позволит потребителям придерживаться принципов здорового питания. CFIA разрабатывает стандарты упаковки, маркировки, рекламы пищевых продуктов, выполняет контрольные и надзорные функции, а также отвечает за регулирование семян, ветеринарных препаратов, удобрений и кормов. Кроме того, CFIA отвечает за разработку постановлений и руководств, относящихся к проведению оценки безопасности кормов для животных, полученных из растений с новыми признаками, а также к экологической экспертизе таких растений, тогда как Министерство здравоохранения отвечает за разработку постановлений и руководств, относящихся к оценке безопасности новых источников пищи [16].

Во исполнение положений Закона о пище и лекарствах Канады (Canadian food and drugs act) было принято Постановление о новой пище (Novel food regulations), в соответствии с которым под определение «новая пища» подпадали следующие продукты:

1. Вещества, включая микроорганизмы, не имеющие истории безопасного использования в пищу;
2. Пища, которая была переработана, обработана, сохранена или упакована способом, который:

– не применялся ранее для данного вида пищевой продукции;

– явился причиной значительных изменений данной пищевой продукции.

1. C. Пища, полученная из растений, животных или микроорганизмов, геном которых был модифицирован:

– растение, животное или микроорганизм, демонстрирующее качество, исходно ему не свойственное;

– растение, животное или микроорганизм, демонстрирующее потерю исходно свойственных ему качеств;

– растение, животное или микроорганизм, демонстрирующее одно или более свойственных ему качеств в пределах, выходящих за рамки физиологических колебаний.

Согласно требованиям Постановления о новой пище производитель обязан представить информацию о готовящемся выпуске на продовольственный рынок нового продукта в соответствующий авторизованный орган (Министерство здравоохранения Канады). Министерство здравоохранения, в свою очередь, должно запросить все необходимые данные о безопасности данного продукта в соответствии с требованиями Руководства по оценке безопасности новой пищи (Guidelines for the Safety Assessment of Novel Foods, 2006).

Следует отметить, что причисление продукта к категории «новая пища» в большей степени обусловлено свойствами продукта и в меньше степени — технологией его получения. К настоящему времени Министерством здравоохранения Канады разрешены более 100 видов новой пищи; безопасность каждого из продуктов была исследована в соответствии с требованиями Руководства по оценке безопасности новой пищи. Оценка безопасности новой пищи основана на потенциальном риске, который может представлять новая пища в сравнении с традиционным аналогом, основное внимание уделяется оценке влияния нового признака на безопасность данного продукта. В качестве примеров новой пищи, находящейся в этом списке, можно привести следующее: диацилглицероловое масло, не имеющее истории безопасного применения в пищу; обработанный УФ-излучением яблочный сок, что значительно повлияло на его микробиологические показатели; ГМ-растения, устойчивые к пестицидам и насекомым.

Таким образом, канадский подход представляет собой уникальную, отличную от других систему регулирования новой пищи, которая охватывает более широкий спектр продуктов благодаря продукт-обусловленному подходу причисления продукта к соответствующей категории новой пищи, тогда как во всем мире принято использовать процесс-обусловленный подход [1–7].

Российская Федерация

В РФ безопасность использования ГМО для пищевых целей обеспечивают 4 взаимодополняющих компонента системы государственного регулирования, закрепленные в законодательстве:

– наличие надежной системы оценки безопасности ГМО;

– эффективная система контроля за оборотом ГМО в России;

– мониторинг воздействия ГМО на человека и окружающую среду;

– доступность для потребителей информации об использовании ГМО при производстве пищевых продуктов.

Разработка соответствующей законодательной, нормативной и методической базы была начата в конце 1990-х гг. В работе принимали участие учреждения Российской академии наук, Российской академии медицинских наук, Российской академии сельскохозяйственных наук, Роспотребнадзор, Минздравсоцразвития России, Минобрнауки России. Опыт межведомственного комплексирования для формирования лучшей практики использования ГМО в пищевой промышленности сохранен и по сей день, развитие генной инженерии требует не только непрерывного совершенствования и актуализации инструментов регулирования, но и фундаментальных и прикладных научных разработок в области обеспечения безопасности и контроля за ГМО, поэтому в работе участвуют Российская академия наук и учреждения ФАНО России, а также федеральные органы исполнительной власти — Роспотребнадзор, Росстандарт, Минздрав России, Минобрнауки России.

В настоящее время в РФ применение высоких современных технологий (в частности, биотехнологии) в области создания продовольственной базы страны является одним из государственных приоритетов. Для осуществления этой деятельности создана актуализированная нормативно-правовая и методическая база:

– Федеральный закон «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» (№ 86-ФЗ от 05.07.1996);

– Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (№ 52-ФЗ от 30.03.1999);

– Федеральный закон «О качестве и безопасности пищевых продуктов» (№ 29-ФЗ от 02.01.2000);

– Федеральный закон «О защите прав потребителей» (№ 2300-1 от 07.02.1992);

– Указ Президента РФ «Об утверждении Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (№ 120 от 30.01.2010);

– Указ Президента РФ «Об утверждении приоритетных направлений развития науки, технологий и техники в Российской Федерации и перечня критических технологий Российской Федерации» (№ 899 от 07.07.2011);

– Постановление Правительства РФ «О Государственной программе развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013–2020 гг.» (№ 717 от 14.07.2012);

– Распоряжение Правительства РФ «Об утверждении Основ государственной политики Российской Федерации в области здорового питания населения на период до 2020 г.» (№ 1873-р от 25.10.2010);

– Распоряжение Правительства РФ «Об утверждении Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013–2020 гг. (№ 2237-р от 03.12.2012);

– Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года, утверждена Правительством Российской Федерации (№ 1853п-П8 от 24.04.2012);

– Постановление Правительства Российской Федерации «О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы» (№ 839 от 23.09.2013);

– Постановление Правительства Российской Федерации «О внесении изменения в Постановление Правительства Российской Федерации от 23 сентября 2013 г. № 839» (№ 548 от 16.06.2014);

– МУ 2.3.2.2306-07 «Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения»;

– МУК 4.2.2304-07 «Методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения»;

– МУК 4.2.1903-04 «Продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа»;

– МУ 2.3.2.1917-04 «Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги»;

– МУК 4.2.3105-13 «Порядок и методы идентификации и количественного определения в пищевых продуктах ГМО, полученных с использованием новых биотехнологий»;

– МУК 4.2.3309-15 «Методы идентификации и количественного определения новых линий ГМО 2-го поколения в пищевых продуктах»;

– ГОСТ Р 52173-2003 «Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения»;

– ГОСТ Р 52174-2003 «Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа»;

– ГОСТ Р53214–2008 (ИСО 24276:2006) «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения»;

– ГОСТ Р53244–2008 (ИСО 21570:2005) «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот»;

– ГОСТ Р ИСО 21571–2014 (ИСО 21571:2005) «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот»;

– МУК 2.3.2.1830-04 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов»;

– МУК 4.2.2305-07 «Определение генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги, в пищевых продуктах методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР с электрофоретической детекцией»;

– МУ 2.3.2.2789-10 «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов»;

– МУ 2.3.2.3388-16 «Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками»;

– МУК 4.2.3389-16 «Валидация методов, предназначенных для выявления и идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов в пищевых продуктах и продовольственном сырье»;

– МУК 4.2.3390-16 «Детекция и идентификация ГМО растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции в матричном формате».

Российская система оценки безопасности ГМО в настоящее время является одной из самых строгих в мире. В отличие от подходов, принятых в Евросоюзе и США, где при подтверждении композиционной эквивалентности ГМО его традиционному аналогу набор исследований может быть сокращен, в России оценка безопасности ГМО включает проведение полного спектра исследований, выполнение каждого из которых обязательно. Начиная с момента формирования российская система оценки безопасности ГМО включала обязательное проведение хронического токсикологического эксперимента длительностью не менее 180 дней — такой подход был принят Евросоюзом с 2004 г., причем в ЕС длительность исследований составляет лишь 90 дней. С 2011 г. оценка безопасности новых линий ГМО в рамках процедуры их государственной регистрации в России включает также проведение исследований репродуктивной токсичности в экспериментах на поколениях животных.

На рынок РФ поступает для регистрации продукция, которая прошла весь цикл исследований, разрешена и уже не один год без ограничений используется в питании населения не только страны-изготовителя (чаще всего США), но и других стран (Канада, страны Евросоюза, Китай и др.), т.е. из-за определенного отставания в области внедрения в практику новейшей биотехнологии Россия имеет возможность использовать данные пострегистрационного мониторинга, проведенного в странах, уже использующих ГМО в питании населения.

Оценка безопасности ГМО проводится на этапе государственной регистрации. Государственной регистрации подлежат новые пищевые продукты, полученные из ГМО растительного происхождения, изготовленные в РФ, а также пищевые продукты, полученные из ГМО растительного происхождения, ввоз которых на территорию РФ осуществляется впервые. Требования к проведению оценки безопасности изложены в МУ 2.3.2.2306-07 «Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения» и в МУ 2.3.2.3388-16 «Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками».

Медико-биологическая оценка безопасности пищевых продуктов, полученных из ГМО растительного происхождения, включает:

– экспертный анализ и оценку данных, представленных заявителем;

– экспертный анализ методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО в пищевых продуктах;

– медико-генетическую оценку;

– оценку функционально-технологических свойств;

– медико-биологические исследования.

Перечень и объем необходимых исследований определяется на основании анализа информации об объекте регистрации, представленной заявителем, однако выполнение каждого из перечисленных блоков исследований обязательно.

Отправной точкой медико-биологических исследований ГМО являются гигиенические исследования, включающие определение показателей качества и безопасности. Перечень показателей безопасности формируется на основании требований технических регламентов Таможенного Союза (ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» и/или соответствующих технических регламентов, устанавливающих обязательные требования к отдельным видам пищевой продукции). Перечень показателей качества формируется на основании свойств соответствующего растительного организма, а также анализа представленных заявителем материалов.

Изучаемые показатели:

– содержание токсичных элементов;

– содержание микотоксинов;

– содержание пестицидов;

– содержание радионуклидов;

– содержание вредных примесей;

– микробиологические показатели;

– другие показатели (в случае необходимости).

Изучение репродуктивной токсичности и токсичности ГМО проводится в эксперименте на крысах линии Вистар (табл. 31.2). Токсикологические исследования включают изучение репродуктивной функции крыс поколения F₀, пре- и постнатальное развитие потомства поколения F₁, а также оценку физиолого-биохимических показателей крыс поколения F₀ (на основании данных о динамике массы тела, абсолютной и относительной массе внутренних органов; данных гематологических, морфологических и биохимических исследований, состояния антиоксидантного статуса и функционального состояния систем, осуществляющих защиту организма от воздействия токсичных соединений экзо- и эндогенного происхождения).

Таблица 31.2. Условия проведения эксперимента

Вид животных	Крысы линии Вистар
Пол	Самцы, самки
Возраст	25–30 дней
Исходная масса тела	70–80 г
Количество животных в группе в начале эксперимента	Не менее 80 особей в каждой группе: 55 ♀, 25 ♂. Все животные должны быть выбраны из пометов со сходной численностью и выживаемостью потомства, при невозможности такой стандартизации количество животных в группах должно быть увеличено не менее чем в 2 раза: 110 ♀, 50 ♂
Распределение по группам	Животных делят на 2 группы: – группа «контроль» получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; – группа «опыт» получает рацион с включением исследуемого ГМО
Рацион	Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных
Карантин	Не менее 7 дней
Условия содержания	Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении
Отбор материала для гематологических, биохимических, морфологических исследований	У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество животных, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу

На протяжении эксперимента животные получают полусинтетический казеиновый рацион (ПКР). Исследуемый ГМО и его традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена ингредиентов рациона должна быть проведена с учетом содержания белков, жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности.

Продуктовый набор и химический состав базового ПКР представлен в табл. 31.3–31.4.

Таблица 31.3. Состав базового полусинтетического казеинового рациона

Ингредиенты	Кол-во, г	Белок, г	Жиры, г	Углеводы, г	Калорийность
					ккал	%
Казеин	23,949	20,21	0,36	–	84,08	23,46
Крахмал маисовый	59,0	0,59	–	51,07	206,64	57,65
Масло подсолнечное нерафинированное	5,0	–	4,99	–	44,91	12,53
Лярд	2,0	–	1,99	–	17,91	5,00
Солевая смесь1	3,5	–	–	–	-	-
Смесь водорастворимых витаминов2	1,0	–	–	1,0	4,00	1,11
Смесь жирорастворимых витаминов3	0,1	–	0,1	–	0,9	0,25
L-цистеин	0,2	–	–	–	–	–
Холин	0,25	–	–	–	–	–
Трет-бутилгидрохинон	0,001	–	–	–	–	–
Микрокристаллическая целлюлоза	5,0	м	–	–	–	–
ИТОГО	100,0	20,80	7,44	52,07	358,44	100

 

Примечания. ¹ Состав солевой смеси представлен в табл. 4.

² 1 г содержит: тиамина (В₁) — 0,6 мг, рибофлавина (В₂) — 0,6 мг, пиридоксина (В₆) — 0,7 мг никотиновой кислоты — 3,0 мг, пантотената кальция — 1,6 мг, фолиевой кислоты — 0,2 мг, биотина — 0,02 мг, цианокобаламина (В₁₂) — 0,0025 мг, викасола — 0,075 мг, L-метионина — 50 мг, глюкозы — до 1 г.

³ 0,1 мл содержит: ретинола ацетата — 400 МЕ, эргокальциферола — 100 МЕ, a-токоферола ацетата — 7,5 мг, подсолнечного масла — до 0,1 мл.

Таблица 31.4. Состав солевой смеси

Название соли	Химическая формула	Количество, г
Кальций углекислый	CaCO3	357,00
Калий фосфорнокислый, однозамещенный	KH2PO4	196,00
Калий сернокислый	K2SO4	46,60
Калий лимоннокислый, моногидрат	HOC(COOK)(CH2COOK)2×Н2O	70,78
Натрий хлористый	NaCl	74,00
Магния окись	MgO	24,00
Железо лимоннокислое	C6H5FeO7	6,06
Цинк углекислый	ZnCO3	1,65
Марганец углекислый	MnCO3	0,63
Медь углекислая	CuCO3×Cu(OH)2	0,30
Калия йодат	KIO3	0,01
Натрия селенат	Na2SeO4	0,01025
Парамолибдат аммония	(NH4)6Mo7O24×4H2O	0,00795
Натрия метасиликат	Na2O3Si×9H2O	1,45
Хромовокалиевые квасцы	CrK(SO4)2×12H2O	0,275
Борная кислота	H3BO3	0,0815
Натрий фтористый	NaF	0,0635
Никель углекислый	2NiCO3×3Ni(OH)2×4H2O	0,0318
Аммоний ванадиевокислый	NH4VO3	0,0066
Сахароза	C12H22O11	221,0434
ИТОГО		1000

Сроки и периодичность сбора данных представлены в табл. 31.5.

Таблица 31.5. Интегральные показатели, сроки и периодичность сбора данных

Изучаемые показатели	Сроки и периодичность сбора данных
Общее состояние животных (внешний вид, двигательная активность, состояние шерстного покрова)	Ежедневно
Поедаемость корма	Ежедневно
Масса тела	Каждые 7 дней
Масса тела самок во время беременности	С 1-го по 20-й дни беременности — у самок, предназначенных для изучения пренатального развития потомства — каждые 5 дней. С 1-го дня беременности до момента родов — у самок, предназначенных для изучения постнатального развития потомства — каждые 5 дней
Масса внутренних органов (головной мозг, сердце, селезенка, легкие, тимус, гипофиз, печень, почки, простата, надпочечники, семенники) у самцов поколения F0	Не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу
Масса внутренних органов (головной мозг, сердце, селезенка, легкие, тимус, гипофиз, печень, почки, надпочечники, яичники) у беременных самок поколения F0 — на 20-й день беременности	Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу

Репродуктивную функцию оценивают по генеративной и эндокринной функции гонад родительских животных поколения F₀, пренатальному и постнатальному развитию потомства поколения F₁ (табл. 31.6–31.8).

Таблица 31.6. Показатели, характеризующие генеративную функцию

Изучаемые показатели [1, 2]	Сроки сбора данных
Эффективность спаривания самцов и самок. Оценивают способность к оплодотворению самок и самцов, выраженную в процентном соотношении забеременевших самок/оплодотворивших самцов к общему количеству ссаженных самок/самцов. Для получения потомства F1 самок F0 ссаживают с самцами F0 в соотношении 2:1 не менее чем на 7 дней	В период ссаживания половозрелых крыс поколения F0 (возраст не менее 100 дней) с целью получения потомства F1 для оценки постнатального развития. Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 30 на группу
Эндокринная функция яичников и семенников. Оценивают по содержанию эстрадиола, прогестерона и тестостерона в сыворотке крови	У беременных самок поколения F0 — на 20-й день беременности. Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу. У самцов поколения F0 — не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу
Дополнительные исследования
Спермограмма. Оценивают макроскопические параметры эякулята — pH, объем спермы, цвет, время разжижения и вязкость эякулята, а также характеристики клеточных элементов спермы — количество, подвижность, жизнеспособность, морфология сперматозоидов, количество и типы лейкоцитов, количество и типы незрелых клеток сперматогенеза и пр.	У половозрелых самцов поколения F0 или F1 (возраст не менее 100 дней). Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу
Морфологические исследования семенников (определяют индекс сперматогенеза, среднее количество нормальных сперматогоний в каждом канальце, относительное количество канальцев с 12-й стадией мейоза)	У самцов поколения F0 — не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу
Морфологические исследования яичников (примордиальные фолликулы, фолликулы с двумя и более слоями фолликулярных клеток, третичные фолликулы, атретические тела, желтые тела, общее количество генеративных форм)	У беременных самок поколения F0 — на 20-й день беременности. Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу

Таблица 31.7. Показатели, характеризующие пренатальное развитие потомства

Изучаемые показатели	Сроки сбора данных
Эвтаназия и вскрытие не менее 15 беременных самок на группу	20-й день беременности
Визуальное исследование матки, плаценты, плодов: выявление живых и мертвых плодов, подсчет количества желтых тел, мест имплантации, количество резорбций по правому и левому рогу матки (с последующим вычислением пред- и постимплантационной гибели)
Оценка развития плодов: макроскопический осмотр, определение массы и краниокаудального размера плодов. После осмотра, измерения и взвешивания плоды каждого помета необходимо разделить на 3 равные группы: 1-я группа предназначена для вскрытия, выделения и взвешивания внутренних органов (печени, почек, сердца, легких); плоды 2-й группы фиксируют в жидкости Буэна и используют для изучения внутренних органов по методу J.G. Wilson; плоды 3-й группы фиксируют в 96º этаноле и используют для изучения состояния скелета по методу A.B. Dawson

Таблица 31.8. Показатели, характеризующие постнатальное развитие потомства

Изучаемые показатели	Сроки сбора данных
Контроль рождения потомства	Самки поколения F0, 22–25-й дни беременности
Определение средней величины помета, подсчет количества живых и мертвых крысят, подсчет особей разного пола, выявление внешних уродств	1-й день жизни крысят поколения F1
Измерение массы тела и роста (краниокаудального размера) крысят поколения F1	2-й, 5-й, 10-й, 15-й, 20-й и 25-й дни жизни крысят поколения F1
Учет показателей физиологического развития крысят: срок отлипания ушных раковин, появление первичного волосяного покрова, прорезывание резцов, открытие глаз, опускание семенников, открытие влагалища.	1–35-й дни жизни крысят поколения F1
Вычисление выживаемости потомства с 1 по 5-й дни жизни (отношение числа крысят, доживших до 5-го дня, к числу родившихся живыми) и с 6-го по 25-й дни жизни (отношение числа крысят, доживших до 25-го дня, к числу доживших до 6-го дня), выраженное в процентах	1–25-й дни жизни крысят поколения F1
Определение соотношения самцов и самок в пометах	1–10-й дни жизни крысят поколения F1

Физиолого-биохимические показатели состояния здоровья крыс поколения F₀ оценивают на основании данных о динамике массы тела, об абсолютной и относительной массе внутренних органов; данных гематологических, морфологических и биохимических исследований, состояния антиоксидантного статуса и функционального состояния систем, осуществляющих защиту организма от воздействия токсичных соединений экзо- и эндогенного происхождения (табл. 31.9–31.16).

Таблица 31.9. Общий клинический анализ крови

Изучаемые показатели	Сроки отбора материала
Концентрация гемоглобина. Гематокрит. Общее количество эритроцитов. Средний объем эритроцита. Среднее содержание гемоглобина в эритроците. Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (СКЭ). Общее количество тромбоцитов. Тромбокрит. Средний объем тромбоцита. Общее количество лейкоцитов. Дифференцированный подсчет лейкоцитарной формулы (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы, моноциты, базофилы)	У самцов поколения F0 — не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу

Таблица 31.10. Общий биохимический анализ сыворотки крови

Изучаемые показатели	Сроки отбора материала
Общий белок. Альбумин. Глобулин. Триглицерид. Общий билирубин. Прямой билирубин. Мочевина. Мочевая кислота. Креатинин. Глюкоза. Холестерин. Лактатдегидрогеназа. α-Амилаза. Креатинфосфокиназа. Щелочная фосфатаза. Аланинаминотрансфераза. Аспартатаминотрансфераза. Кальций. Магний. Железо. Натрий. Калий. Фосфор. Хлор	У самцов поколения F0 — не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу

Таблица 31.11. Общий и биохимический анализ мочи

Изучаемые показатели	Сроки отбора материала
Суточный диурез. Цвет и прозрачность. Относительная плотность. pH. Белок. Глюкоза. Креатинин. Мочевина. Мочевая кислота. Кальций. Магний. Фосфор	У самцов поколения F0 — не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу

Таблица 31.12. Системные биомаркеры (система антиоксидантной защиты)

Изучаемые показатели	Сроки отбора материала
Активность ферментов антиоксидантной защиты. Материал для исследований: эритроциты [3–8] – Глутатионредуктаза – Глутатионпероксидаза – Супероксиддисмутаза – Каталаза	У самцов поколения F0 — не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу
Содержание продуктов перекисного окисления липидов. Материал для исследований: кровь, печень [9–11] – Малоновый диальдегид

Таблица 31.13. Системные биомаркеры (система ферментов метаболизма ксенобиотиков)

 

Изучаемые показатели	Сроки отбора материала
Активность ферментов 1-й и 2-й фазы метаболизма ксенобиотиков [12–16] Материал для исследований: печень – Общее содержание цитохрома Р-450. – Этоксирезоруфиндеалкилаза. – Пентоксирезоруфиндеалкилаза. – УДФ-глюкуронозилтрансфераза. – ХДНБ-глутатионтрансфераза	У самцов поколения F0 — не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 10 на группу

Таблица 31.14. Системные биомаркеры (стабильность мембран лизосом)

Изучаемые показатели	Сроки отбора материала
Общая и неседиментируемая активность ферментов лизосом [17] Материал для исследований: печень – β-Галактозидаза. – β-Глюкуронидаза. – Арилсульфатазы А и В	У самцов поколения F0 — не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу

Таблица 31.15. Системные биомаркеры (интенсивность процессов апоптоза)

Изучаемые показатели	Сроки отбора материала
Щелочной гель-электрофорез изолированных клеток (метод «ДНК-комет») Материал для исследований: печень, тимус, почки – Индекс апоптоза. – Степень фрагментации ДНК	У самцов поколения F0 — не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу

Таблица 31.16. Морфологические исследования

Исследуемые органы	Методы исследований [18–28]
Головной мозг. Гипофиз. Сердце. Тимус. Легкие. Печень. Селезенка. Почки. Надпочечники. ЖКТ: желудок, тонкая и толстая кишка. Яичники. Семенники. Простата	Отбор материала у самцов поколения F0 — не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу. 1. Макроскопические исследования. 2. Микроскопические исследования: а) обзорные гистологические исследования; 3. Морфометрический анализ.
	Вскрытие погибших в течение эксперимента животных (внеплановый отбор) 1. Макроскопические исследования. 2. Микроскопические исследования (перечень исследуемых органов может быть сокращен до минимально необходимого для установления причины смерти): а) обзорные гистологические исследования
	Дополнительные исследования 1. Микроскопические исследования: а) гистохимические исследования; б) иммуногистохимические исследования клеточных популяций и их производных. 2. Электронно-микроскопические исследования

Токсикологические исследования проводят на лабораторных животных (крысы линии Вистар, исходный возраст ~25–30 дней), в рацион которых включают изучаемый ГМО (опытная группа) и его традиционный аналог (контрольная группа) в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Во время эксперимента ведут динамическое наблюдение за интегральными (внешний вид, масса тела и др.), гематологическими, биохимическими и морфологическими показателями, также проводятся исследования репродуктивной функции, пре- и постнатального развития потомства.

Отличительной чертой системы оценки безопасности ГМО, принятой в РФ, является использование показателей (системных биомаркеров), отражающих уровень адаптации организма к окружающей среде и обладающих высокой чувствительностью к чужеродному воздействию.

Особое внимание уделяется системам, осуществляющим защиту организма от воздействия токсичных соединений экзо- и эндогенного происхождения: системе ферментов метаболизма ксенобиотиков, системе регуляции апоптоза, системе антиоксидантной защиты.

В системе медико-биологических исследований безопасности ГМО растительного происхождения наряду с общетоксикологическими исследованиями важное место принадлежит изучению специфических видов токсичности в экспериментах in vivo. В соответствии со сложившейся исследовательской практикой используется комплексный подход, предоставляющий наиболее полную и достоверную информацию о потенциальном генотоксическом, иммунотоксическом и аллергенном действии ГМО, а также позволяющий выявить возможные незаданные эффекты генетической модификации. Так, изучение генотоксического действия ГМО включает оценку состояния генетического материала на разных уровнях организации (молекулы ДНК — хромосомы); изучение иммунотоксического действия — оценку иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств ГМО в эксперименте на мышах оппозитно реагирующих линий; изучение аллергенного действия — оценку тяжести активного анафилактического шока и интенсивности гуморального иммунного ответа на модели системной анафилаксии у крыс.

Иммунологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на мышах линий СВА и С57Bl/6 и включают изучение иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по 4 тестам:

– действие на гуморальное звено иммунитета — в тесте определения уровня гемагглютининов к эритроцитам барана;

– действие на клеточное звено иммунитета — в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана;

– действие как сенсибилизирующего агента — в тесте чувствительности к гистамину;

– действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа).

Аллергологические исследования ГМО с комбинированными признаками проводятся в эксперименте на лабораторных животных: потенциальную аллергенность оценивают, определяя тяжесть протекания системной анафилаксии и уровня циркулирующих сенсибилизирующих антител (cубклассов IgG1 + IgG4) у крыс, получающих в составе рациона исследуемый ГМО (группа «опыт») и его традиционный аналог (группа «контроль»). В случае исследования ГМО, полученных гибридизационным методом, в рационе лабораторных животных в качестве традиционного аналога используется смесь традиционных аналогов исходных ГМ-линий. Метод основан на количественной сравнительной оценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (в/б) сенсибилизации взрослых крыс пищевым антигеном — овальбумином куриного яйца (ОВА) с последующим внутривенным (в/в) введением сенсибилизированным животным разрешающей дозы того же белка [32].

Генотоксикологические исследования ГМО с комбинированными признаками проводятся в эксперименте на лабораторных животных. Оценка потенциальной генотоксичности ГМО включает выявление повреждений ДНК и выявление мутагенной активности в эксперименте in vivo. Метод выявления мутагенной активности основан на учете хромосомных аберраций в метафазных клетках пролиферирующих тканей [35]. Регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет) [36].

Решение о государственной регистрации ГМО растительного происхождения в РФ основано на совокупности экспертной оценки материалов, представленных заявителем, результатов комплексной медико-биологической оценки безопасности, медико-генетической и технологической оценки, а также экспертной оценки методов идентификации ГМО.

За период с 1999 по 2016 г. в России полный цикл медико-биологических исследований прошли 23 линии ГМО. К 2016 г. накоплена научная база по безопасности ГМО, включающая анализ результатов исследований, проведенных в рамках процедуры регистрации ГМО в РФ, а также данные отечественной и мировой научной литературы, посвященной проблеме безопасности биотехнологической продукции как на этапе регистрации, так и на этапе пострегистрационного мониторинга.

Разумеется, наука не стоит на месте, интенсивная работа по оптимизации методической базы, использование передовых научных разработок, обмен информацией в мировом сообществе внушают уверенность в опережающих темпах развития современных научных знаний, в частности в целях обеспечения безопасности новых пищевых продуктов.

Маркировка ГМ пищевой продукции и методы контроля

Подход к маркировке ГМ пищевой продукции осуществляется с учетом требований российской общественности и действующих международных норм. Маркировка, введенная в 1999 г. в качестве рекомендательной меры (Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации № 13 от 08.04.99), уже к 2002 г. приняла обязательный характер. Установленный ею порог снизился с 5% в 2002 г. до 0,9% в 2007 г., став нормой, гармонизованной с аналогичной в странах Евросоюза (СанПиН 2.3.2.2227-07, ФЗ «О внесении изменений в закон Российской Федерации «О защите прав потребителей» № 234-ФЗ от 25.10.2007, Технический регламент ТС 022/2011). Следует отметить, что маркировка ГМ-продукции не связана с ее безопасностью, а предназначена для информирования потребителей о применении генно-инженерных технологий при производстве пищевого продукта.

Требования действующего законодательства РФ, интенсивное развитие технологий генной инженерии и использование ГМ продовольственного сырья при производстве пищевой продукции обуславливают необходимость применения надежных и достоверных методов контроля за оборотом ГМО. Система контроля за оборотом ГМО на продовольственном рынке РФ разработана на основании фундаментальных исследований, проведенных РАН, РАМН, РАСХН и внедрена в практику Роспотребнадзора, агропромышленного комплекса страны, таможенной службы и других заинтересованных ведомств.

Методическая база включает самые современные методы, основанные на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, иммуно-флуоресцентном анализе.

В настоящее время подавляющее большинство ГМО растительного происхождения, представленных на рынке, отличаются от традиционных аналогов наличием в геноме рекомбинантной ДНК и экспрессированным на ее основе белком, определяющим проявление нового признака. Таким образом, мишенями для определения присутствия ГМО в продукте могут быть как рекомбинантная ДНК, так и белок. Методы определения белка основаны на использовании иммуноферментного анализа (ИФА), имеющего ряд преимуществ, связанных с простым форматом и сравнительно низкой стоимостью исследований. В то же время есть существенные ограничения для широкого применения ИФА при мониторинге за оборотом ГМО на продовольственном рынке. Во-первых, при исследовании технологически обработанных пищевых продуктов (подвергавшихся действию высоких температур, кислой среды, ферментативной обработки и др.) ИФА может давать нестабильные, плохо воспроизводимые или ложно-отрицательные результаты из-за денатурации белка [13]; во-вторых, возможность определения белка лимитируется его количеством в растении (большинство ГМ-культур, представленных на мировом продовольственном рынке, содержат новый белок в количестве не более 0,05% от общего содержания белка в частях растений, употребляемых в пищу) [16]; в-третьих, тесты, основанные на идентификации белка, являются лишь скрининговыми и не позволяют провести идентификацию ГМО. Наиболее предпочтительными для осуществления контроля за пищевой продукцией, полученной из ГМО, считаются методы определения рекомбинантной ДНК. Последовательность ДНК одинакова во всех клетках организма, поэтому любая часть растения может быть использована для идентификации ГМО. Методы, основанные на определении рекомбинантной ДНК, весьма чувствительны и позволяют выявить присутствие ГМО в рамках скрининговых исследований, а также

идентифицировать ГМО и определить его количество в продукте. По сравнению с белком ДНК более стабильна, и все же она также может разрушаться под действием высокой температуры, облучения ультрафиолетовым светом, обработкой кислотами, а также специфично действующими на ДНК ферментами. Так, при выделении даже большого количества ДНК амплификация может не произойти из-за присутствия в продукте только очень коротких нитей ДНК. Критический размер фрагментов ДНК для выявления методом ПЦР составляют 400 пар нуклеотидов [14]. Показано, что ДНК не определяется в пищевых продуктах, подвергшихся значительной технологической обработке (гидролизованные растительные белки, высокорафинированные масла и крахмалы, соевый соус, сахар и этиловый спирт из ГМ-картофеля или ГМ-кукурузы) [9].

 В настоящее время стратегия скрининга основана на выявлении регуляторных последовательностей, входящих в состав рекомбинантной ДНК — промоторов p35S FMV (из вируса мозаики норичника, Figwort mosaic virus), p35S CaMV (из вируса мозаики цветной капусты, Cauliflower mosaic virus), терминатора tNOS (из почвенных бактерий Аgrobacterium tumefaciens), также могут быть использованы целевые гены (например, ген cp4 epsps из Аgrobacterium tumefaciens, обусловливающий устойчивость к гербициду глифосату; ген pat из Streptomyces viridochromogenes, обусловливающий устойчивость к глюфосинату аммония, и др.) и маркерные гены (например, ген nptII неомицинфосфотрансферазы II из Escherichia coli и др.). Полный перечень генетических элементов, которые могут указывать на наличие рекомбинантной ДНК, приведен в МУК 4.2.3390-16 [25].

Кроме того, вместе с ДНК из пищевых продуктов могут выделиться белки, жиры, полисахариды, полифенолы и другие вещества, способные ингибировать ПЦР, что также создает трудности при проведении анализа.

Только в 2003–2015 гг. учреждениями Роспотребнадзора было проведено более 300 тыс. исследований пищевых продуктов с целью выявления ГМО. На протяжении этого времени действующая система позволяла полностью контролировать оборот ГМО на продовольственном рынке РФ. Однако интенсивное развитие генной инженерии привело к появлению биотехнологических культур II поколения, в том числе культур с комбинированными признаками (gm stacks), ДНК которых или не содержит регуляторных последовательностей или это принципиально новые последовательности, выявление которых требует отдельных длительных исследований. Такие ГМ-культуры потенциально могут присутствовать на рынке и оставаться неидентифицированными в рамках рутинного контроля за оборотом ГМО.

В условиях общемировой тенденции увеличения использования ГМО сохраняется необходимость постоянного совершенствования методов их идентификации для обеспечения установленного законодательством уровня контроля за обращением ГМО на рынке и соблюдением требований маркировки. Появляющиеся на мировом продовольственном рынке новые линии ГМО в ряде случаев не содержат регуляторных последовательностей (промотор 35S, промотор FMV и терминатор NOS), на выявлении которых основана стратегия контроля за ГМО, применяемая в настоящее время. Следовательно, возникает вероятность снижения эффективности контроля за такими ГМО, осуществляемого классическими методами в рамках рутинных скрининговых исследований, а расширенные исследования каждого образца продукции требуют до 100 отдельных анализов.

Для предотвращения существующего риска снижения эффективности контроля за ГМО потребовалась интеграция усилий различных отделений РАН, были проведены интенсивные исследования в области создания методической и приборной базы, которая позволит обеспечить надлежащий уровень контроля за оборотом новых поколений ГМО. В результате проделанной работы был создан новый формат ПЦР — предподготовленные, свободно конфигурируемые ПЦР-матрицы и оптимизированные тест-системы, позволяющие выявлять и идентифицировать большинство известных линий ГМО в рамках одного анализа. Значительная часть используемых в этих тест-системах специфических реактивов (праймеры, ДНК-зонды) широко апробированы и используются для выявления и идентификации ГМО. Технические особенности проведения ПЦР с использованием ПЦР-матриц дают возможность значительно (в 2–3 раза) сократить время проведения реакции за счет существенного увеличения скорости термоциклирования, а также снизить расход реактивов — за счет уменьшения реакционного объема (со стандартных 20–30 мкл до 1,2 мкл).

Общая схема лабораторных исследований включает (рис. 33.3):

Рис. 33.3. Общая схема лабораторных исследований продукции на содержание генно-модифицированных организмов

Определение вероятных трансформационных событий, присутствующих в образце, по комплексу обнаруженных генетических элементов проводится с использованием баз данных трансформационных событий и генетических элементов (например, баз данных CERA http://cera-gmc.org/GMCropDatabase, GMOseekSoftware http://www.gmoseek.com/ gmoseek).

В образце обнаружен (обнаружены) ГМО, если выполнено хотя бы одно из следующих условий:

– обнаружены событие-специфичные последовательности одного или нескольких трансформационных событий;

– обнаружено не менее 2 генетических элементов, относящихся к следующим группам: регуляторные генетические элементы, маркерные гены, смысловые гены.

Обнаружение в образце только одного генетического элемента, относящегося к вышеперечисленным группам, не может служить однозначным свидетельством содержания ГМО в образце, так как большинство регуляторных генетических элементов, маркерных и смысловых генов могут присутствовать в геномной ДНК природных объектов.

Например, если в образце присутствуют растительные компоненты, относящиеся к семейству крестоцветных (Brassicaceae) — рапс, капуста и другие, то обнаружение в таком образце 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты (Cauliflower mosaic virus, CaMV) может являться подтверждением присутствия данного вируса в исходном растительном сырье. Природа соответствующего генетического элемента (35S-промотор из ГМО или 35S-промотор из полноценного вируса мозаики цветной капусты) может быть определена в дополнительных исследованиях.

В соответствии с современными требованиями, действующими на территории Таможенного союза, запрещено использование ГМО в детском, лечебном и профилактическом питании (ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции»). Согласно этому техническому регламенту, если содержание ГМО в пересчете на отдельный ингредиент составляет менее 0,9%, то ГМО является случайной или технически неустранимой примесью, и такая пищевая продукция не относится к пищевой продукции, содержащей ГМО.

Таким образом, за последние годы в России была проделана большая научная работа, по направлениям обеспечения безопасности и контроля за ГМО, накоплен значительный фактический материал, создана нормативно-методическая база и существенный задел для дальнейших фундаментальных и прикладных научных исследований в области создания, обеспечения безопасности и методов выявления ГМО в объектах окружающей среды. Необходима дальнейшая разработка новых методических подходов на основе интеграции усилий не только научных учреждений медицинского и биологического профиля, но и учреждений химического, физического и других направлений.

Литература

1. Melo E.O., Canavessi A.M., Franco M.M., Rumpf R. Animal transgenesis: state of the art and applications // J. Appl. Genet. 2007. Vol.48, N 1. P. 47–61.
2. Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А. Биологические проблемы животноводства в ХХI веке. М.: РАСХН, 2008. 501 с.
3. Kues W., Niemann H. Advances infarm animal transgenesis // Prev. Vet. Med. 2011. Vol. 102, N 2. P. 146–156.
4. Bagle T.R., Kunkulol R.R., Baig M.S., More S.Y. Transgenic animals and their application in medicine // Int. J. Med. Res. Health Sci. 2013. Vol. 2, N 1. P. 107–116.
5. RexroadC. E.Jr, Hammer R.E., Behringer R.R. et al. Insertion, expression and physiology of growth-regulating genes in ruminants  // J. Reprod. Fertil. Suppl. 1990. Vol. 41. P. 119–124.
6. Pursel V.G., Hammer R.E., Bolt D.J. et al. Integration, expression and germ-line transmission of growth-related genes in pigs // J. Reprod. Fertil. Suppl. 1990. Vol. 41. P. 77–87.
7. de Koning D.J., Archibald A., Haley C.S. Live-stock genomics: bridging the gap between mice and men // Trends Biotechnol. 2007. Vol.25. P. 483–489.
8. Серов О.Л. Трансгенные животные: фундаментальные и прикладные аспекты// Вавиловский журн. генетики и селекции. 2013. Т. 17, № 4/2. C. 1055–1064.
9. Simons J., Wilmut I., Clark A. et al. Gene transfer into sheep // Biotechnology. 1988. Vol. 6. P. 179–183.
10. Jim K. First US approval for a transgenic animal // Nat. Biotechnol. 2009. Vol. 27, N 4. P.302–304.
11. Grosse-Hovest L., Hartlapp I., Marwan W. et al. A recombinant bispecific single-chain antibody induces targeted, supra-agonistic CD28-stimulation and tumor cell killing // Eur. J. Immunol. 2003. Vol. 33, N 5. P. 1334–1340.
12. Ivarie R. Aviantransgenesis: progress towards the promise // Trends Biotechnol. 2003. Vol. 21. P. 14–19.
13. Rapp J.C., Harvey A.J., Speksnijder G.L. et al. Biologically active human interferon a-2b produced in the egg white of transgenic hens // Transgenic Res. 2003. Vol. 12. P. 569–575.
14. Raju T.S., Briggs J.B., Borge S.M., Jones A.J. Species-specific variation in glycosylation of IgG: evidence for the species-specific sialylation and branch-specific galactosylation and importance for engineering recombinant glycoprotein therapeutics // Glycobiology. 2000. Vol. 10. P. 477–486.
15. Mozdziak P.E., Borwornpinyo S., McCoy D.W., Petitte J.N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase // Dev. Dyn. 2003. Vol.226. P. 439–445.
16. Волкова Н.А., Волкова Л.А., Фомин И.К. и др. Интеграция и экспрессия маркерных генов в эмбрионах кур при использовании ретровирусных экспрессирующихся векторов // Сельскохозяйственная биол. 2013. №2. С. 58–61.
17. Byun S.J., Kim S.W., Kim K.W. et al. Oviduct-specific enhanced green fluorescent protein expression in transgenic chickens // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011. Vol. 75, N 4. P. 646–469.
18. Harvey A.J., Speksnijder G., Baugh L.R. et al. Expression of exogenous protein in G. the egg white of transgenic chickens // Nat. Biotechnol. 2002. Vol. 20. P. 396–399.
19. Lillico S.G., Sherman A., McGrew M.J. et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2007. Vol. 104, N 6. P. 1771–1776.
20. Kwon S.C., Choi J.W., Jang H.J. et al. Production of biofunctional recombinant human interleukin1 receptor antagonist (rhIL1RN) from transgenic quail egg white // Biol. Reprod. 2010. Vol. 82. P. 1057–1064.
21. Kamihira M., Ono K., Esaka K. et al. High-level expression of single-chain Fv-Fc fusion protein in serum and egg white of genetically manipulated chickens by using a retroviral vector // J. Virol. 2005. Vol. 79,N 17. P. 10 864–10 874.
22. Kodama D., Nishimiya D., Nishijima K. et al. Chicken oviduct-specific expression of transgene by hybrid ovalbumin enhancer and the Tet expression system // J. Biosci. Bioeng. 2012. Vol. 113, N 2. P. 46–153.
23. Шумаков В.,Тоневицкий А. Ксенотрансплантация: научные и этические проблемы // Человек. 1999. № 6.
24. Dai Y., Vaught T.D., Boone J. et al. Targeted disruption of the alpha 1,3-galactosyltransferase gene in cloned pigs // Nat. Biotechnol. 2002. Vol. 20. P. 251–255.
25. Phelps C.J., Koike C., Vaught T.D. et al. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs // Science. 2003. Vol. 299, N 5605. P. 411–414.
26. Kolber-Simonds D., Lai L., Watt S.R. et al. Production of alpha-1,3-galactosyltransferase null pigs by means of nuclear transfer with fibroblasts bearing loss of heterozygosity mutations // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2004. Vol. 101, N 19. P. 7335–7340.
27. Lai L., Kolber-Simonds D., Park K.W. et al. Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning // Science. 2002. Vol.295, N 5557. P. 1089–1092.
28. Зиновьева Н.А., Мелерзанов А.В., Петерсен Е.В. и др. Использование трансгенных GAL-KO свиней в ксенотрансплантации: проблемы и перспективы // Сельскохозяйственная биол. 2014. № 2. С. 42–49.
29. Luo Y., Lin L., Bolund L., Jensen T.G. Genetically modified pigs for biomedical research // J. Inherit. Metab. Dis. 2012. Vol. 35, N 4. P. 695–713.
30. Aigner B., Renner S., Kessler B., Klymiuk N. et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research // J. Mol. Med. 2010. Vol. 88. P. 653–664.
31. Rogers C.S., Stoltz D.A., Meyerholz D.K. et al. Disruption of the CFTR gene produces a model of cystic fibrosis in newborn pigs // Science. 2008. Vol. 321. P. 1837–184.
32. Wine J.J. The development of lung disease in cystic fibrosis pigs // Sci. Transl. Med. 2010. Vol. 2. Р. 29.
33. Renner S., Fehlings C., Herbach N. Glucose intolerance and reduced proliferation of pancreatic beta-cells in transgenic pigs with impaired glucose-dependent insulinotropic polypeptide function // Diabetes. 2010. Vol. 59. P. 228–1238.
34. Sommer J.R., Estrada J.L., Collins E.B. et al. Production of ELOVL4 transgenic pigs: a large animal model for Stargardt-like macular degeneratio // Br. J. Ophthalmol. 2011. Vol. 95, N 12. P. 1749–1754.
35. Klymiuk N., Böcker W., Schönitzer V. et al. First inducible transgene expression in porcine large animal model // FASEB J. 2012. Vol. 26, N 3. P. 1086–1099.
36. Gordon J.W., Scangos D.J., Plotkin J.A. et al. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 7380–7384.
37. Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E. et al. Dramatic growth of mice that develop from eggs micro-injected with metallothionein-growth hormone fusion gene // Nature. 1982. Vol. 300. P. 611–615.
38. Brem G., Brenig B., Goodman H.M. et al. Production of transgenic mice, rabbits and pig by microinjection into pronuclei  // Zuchtkunde. 1985. Vol. 20. P. 251–252.
39. Hammer R., Pursel V., Rexroad J. et al. Production of trans-genie rabbits, sheep and pigs by microinjection // Nature. 1985. Vol. 315. P. 680–683.
40. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line // Nature.1997. Vol. 380. P. 64–66.
41. Schnieke A., Kind A., Ritchie W. et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts // Science. 1997. Vol. 278. P. 2130–2133.
42. Савченкова И.П., Зиновьева Н.А., Булла Й., Брем Г. Эмбриональные стволовые клетки, их генетическое изменение путем гомологичной рекомбинации и использование в получении трансгенных животных // Успехи соврем. биол. 1996. Т. 116, № 1. С. 78–91.
43. Эрнст Л.К., Волкова Н.А., Зиновьева Н.А. Фенотипический эффект экспрессии рекомбинантных генов в орган. змеи трансгенных животных в разных видах. М.: РАСХН, 2008. 501 с.
44. Chan A., Homan E., Ballou L. et al. Transgenic cattle produced by reverse-transcribed gene transfer in oocytes // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 14 028–14 033.
45. Palmiter R., Sandgren E., Avarbock M. et al. Heterologous introns can enhance expression of transgenes in mice // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 478–482.
46. Jahner D., Jaenisch R. Retorvirus-induced de novo methylation of flanking host sequences correlates with gene inactivity  // Nature. 1985. Vol. 315. P. 594–597.
47. Haskell R., Bowen R. Efficient production of transgenic cattle by retroviral infection of early embryos // Mol. Reprod. Dev. 1995. Vol.40, N 3. P.386–390.
48. Hofmann A., Kessler B., Ewerling S. et al. Efficient transgenesis in farm animals by lentiviral vector // EMBO Rep. 2003. Vol. 4, N 11. P. 1054–1060.
49. Whitelaw C.B., Radcliffe P.A., Ritchie W.A. et al. Efficient generation of transgenic pigs using equine infectious anaemia virus (EIAV) derived vector // FEBS Lett. 2004. Vol. 571. P. 233–236.
50. McGrew M.J., Sherman A., Ellard F.M. et al. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors // EMBO Rep. 2004. Vol. 5. P. 728–733.
51. Gandolfi F. Spermatozoa, DNA binding and transgenic animals // Trans. Res. 1998. Vol.7. P. 147–155.
52. Brackett B.G., Baranska W., Sawikki W., Korpowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization // Proc. Natl Acad. Sсi. USA. 1971. Vol. 68. P.353–357.
53. Perry A.C.F.,Wakayama N., Kishikawa H. et al. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection // Science. 1999. Vol. 284. P. 1180–1183.
54. Chang K., Qian J., Jiang M. et al. Effective generation of transgenic pigs and mice by linker based sperm-mediated gene transfer  // BMC Biotechnol. 2002. Vol. 2. P. 5.
55. Maione B., Lavitrano M., Spadatora C., Kiessling A.A. Sperm-mediated gene transfer in mice // Mol. Reprod. Dev. 1998. Vol. 50. P. 406–409.
56. Brinster R., Nagano M. Spermatogonial stem cell transplantation, cryopreservation and culture // Semin. Cel. Dev. Biol. 1998. Vol. 9, N 4. P. 401–409.
57. Schelander K., Peli J., Small F., Brem G. Artificial insemination in cattle with DNA-treated sperm // Anim. Biotechnol. 1995. Vol. 6. P. 41–50.
58. Sperandio S., Lulli V., Bacci M. et al. Sperm mediated DNA transfer in bovine and swine species // Anim. Biotechnol. 1996. Vol. 7. P. 59–77.
59. Bosch P., Forcato D.O., Alustiza F.E. et al. Exogenous enzymes upgrade transgenesis and genetic engineering of farm animals // Cell. Mol. Life Sci. 2015. Vol. 72. P. 1907–1929.
60. Lee S., Park H., Kong I., Wang Z. 30 a transcription activatorlike effector nuclease (Talen)-mediated universal gene knock-in strategy for mammary glands specific expression of recombinant proteins in dairy cattle // Reprod. Fertil. Dev. 2013. Vol. 26. P. 129–129.
61. Moghaddassi S., Eyestone W., Bishop C.E. TALEN-mediated modification of the bovine genome for large-scale production of human serum albumin // PloS One. 2014. Vol. 9, N 2. Article ID e89631.
62. Cong L., Ran F.A., Cox D. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas system // Science. 2013. Vol. 339, N 6121. P. 819–823.
63. Mali P., Yang L., Esvelt K.M. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9 // Science. 2013. Vol. 339. P. 823–826.
64. Wiedenheft B., Sternberg S.H., Doudna J.A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea // Nature. 2012. Vol. 482. P. 331–338.
65. Wang S., Sun X., Ding F. et al. Removal of selectable marker gene from fibroblast cells in transgenic cloned cattle by transient expression of Cre recombinase and subsequent effects on recloned embryo development // Theriogenology. 2009. Vol. 72. P.535–541.
66. Сингина Г.Н., Лопухов А.В., Зиновьева Н.А. и др. Оптимизация параметров энуклеации и слияния ооцита с соматической клеткой при получении клонированных эмбрионов млекопитающих // Сельскохозяйственная биол. 2013. № 2. С. 46–51.
67. Muramatsu T., Mizutani Y., Ohmori Y., Okumura J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. Vol. 230. P. 376–380.
68. Smith C.A., Roeszler K.N., Sinclair A.H. Robust and ubiquitous GFP expression in a single generation of chicken embryos using the avian retroviral vector. RCASBP // Differentiation. 2009. Vol. 77, N 5. P. 473–482.
69. Miyahara D., Mori T., Makino R. et al. Culture conditions for maintain propagation, long-term survival and germline transmission of chicken primordial germ cell-like cells // J. Poult. Sci. 2014. Vol. 51. P. 87–95.
70. Nakamura Y., Kagami H., Tagami T. Development, differentiation and manipulation of chicken germ cells // Dev. Growth Differ. 2013. Vol. 55. P. 20–40.
71. Tyack S.G., Jenkins K.A., O’Neil T.E. et al. A new method for producing transgenic birds via direct in vivo transfection of primordial germ cells // Transgenic Res. 2013. Vol. 22. P. 1257–1264.
72. Scientific Opinion on the Guidance on the risk assessment of food and feed from genetically modified animals and animal health and welfare aspects // EFSA J. 2012. Vol. 10, N 1. P. 2501–2543.
73. DiGirolamo M., Fine J.B., Tagra K., Rossmanith R. Qualitative regional differences in adipose tissue growth and cellularity in male Wistar rats fed ad libitum // Am. J. Physiol. 1998. Vol. 274. P. 1460–1467.
74. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е. и др. Сравнительная характеристика влияния экспериментальных рационов на рост и развитие крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 5. C. 30–38.
75. Overton J. (ed.). Nutrient Requirements of Laboratory Animals. 4th. ed. Washington, DC: National Academies Press, 1995.
76. Michara M., Uchiyama M., Fukuzawa K. Thiobarbituric acid value on fresh homogenate of rat as a parameter of lipid peroxidation in aging, CCl4 intoxication, and vitamin E deficiency // Biochem. Med. 1980. Vol.23. P. 302–311.
77. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения. Методические указания МУ 2.3.2.2306-07. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. 21 с.
78. Хабриев Р.У. (ред.). Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. 2-изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 2005. 832 с.
79. Wilson J.G. Embryological considerations in teratology // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1965. Vol. 123. P. 219–227.
80. Dawson A.B. A note on the staining of the skeleton of cleared specimens with alizarin red S // Stain Technol. 1926. Vol.1. P. 123–124.
81. Продукты пищевые и вкусовые. Общие указания по определению содержания азота методом Кьельдаля. ГОСТ 26889-86. Введ. 01.01.1987.
82. Руководство по методам контроля качества и безопасности БАД к пище // Руководство Р 4.1.1672-03. Введ. 30.06.2003. М.: Минздрав, 2004.
83. Тутельян В.А. Химический состав и калорийность российских пищевых продуктов: справочник. М.: ДеЛи плюс, 2012. 283 с.
84. Концентраты пищевые. Методы определения золы. ГОСТ 15113.8-77. Взамен ГОСТ 15113.6-69. Введ. 01.01.1979.
85. Зерно. Метод определения влажности. ГОСТ 13586.5-93. Взамен ГОСТ 13586.5-85. Заменяющий ГОСТ 13586.5-2015. Введ. 01.01.1995.
86. Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов. ГОСТ 30178-96. Переиздание 22.04.2010. Введ. 01.01.1998
87. Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения мышьяка. ГОСТ Р 51766-2001. Введ. 01.07.2002.
88. Сырье и продукты пищевые. Методы определения ртути. ГОСТ 26927-86. Введ. 01.12.1986. Взамен ГОСТ 7636-85.
89. Методические указания по определению хлорорганических пестицидов (γ-изомера ГХЦГ, α-изомера ГХЦГ, гептахлора, альдрина, кельтана, ДДЭ, ДДД, ДДТ) при совместном присутствии в воде хроматографическими методами. Методические указания МУ 4120-86.
90. Методика определения афлатоксинов в пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания МУ 4082-86.
91. Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания Т–2 токсина в пищевых продуктах и продовольственном сырье. Методические указания МУК 3184-84.
92. Определение остаточных количеств флутриафола в плодах яблони, ягодах и соке винограда методом газожидкостной хроматографии. Методические указания МУК 1965-05.
93. Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) и зеараленона в зерне и зернопродуктах. Методические рекомендации МУК 5177-90.
94. Методы определения массовой доли бенз(а)пирена. ГОСТ Р 51650-2000. Введ. 01.07.2001.
95. Gentleman R., Carey V., Huber W. et al. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. New York: Springer Science + Business Media, 2005. 473 p.
96. Реброва Ю.А. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиа Сфера, 2006. 312 с.
97. Norusis M.J. SPSS Statistics 17.0 Guide to Data Analysis. Upper Saddle River: Prentice Hall, 2009. 672 p.
98. Мустафина О.К., Трушина Э.Н., Шумакова А.А., Арианова Е.А. и др. Гематологические показатели у крыс Вистар разного возраста, содержащихся на полусинтетическом полноценном виварном рационе // Вопр. питания. 2013. № 2. С. 10–16.
99. Lewi P.J., Marsboom R.P. Toxicology Reference Data — Wister Rat. Amsterdam: Elsevier; North-Holland Biochemical Press, 1981. 358 p.
100. Suckow M.A., Weisbroth S.H., Franklin C.L. The Laboratory Rat. Burlington: Elsevier; Academic Press, 2006. 912 p.
101. Tucker M.J. Diseases of the Wistar Rat. London: Taylor and Francis, 1997. 272 p.
102. Krinke G.J., Bullock G.R., Bunton T. The Laboratory Rat // Handbook of Experimental Animals. New York: Academic Press, 2000. 756 p.
103. Boehm O., Zur B., Koch A. et al. Clinical chemistry reference database for Wistar rats and C57BL/6 mice // Biol. Chem. 2007. Vol. 388. P. 547–554.
104. Scott A.F., Phillips J.A., Young K.E., Kazazian H.H. et al. The molecular basis of hemoglobin Grady // Hum. Genet. 1981. Vol. 33. Р. 129–133.
105. Жминченко В.М., Гаппаров М.М.Г. Современные тенденции исследований в нутрициологии и гигиене питания // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 1. С. 4–15.
106. Kersten S. Mechanisms of nutritional and hormonal regulation of lipogenesis // EMBO Rep. 2001. Vol. 2, N 1. Р. 282–286.
107. Li C., Donizelli M., Rodriguez N., Dharuri H. et al. BioModels Database: An enhanced, curated and annotated resource for published quantitative kinetic models // BMC Syst. Biol. 2004. Vol. 4. P. 92.
108. Das U.N. Biological significance of essential fatty acids // J. Assoc. Physicians India. 2006. Vol. 54. P. 309–319.
109. Consensus document on safety information on transgenic plants expressing Bacillus thuringiensis — derived insect control proteins: Series on Harmonisation of Regulatory Oversight in Biotechnology // OECD Environment Directorate. Paris 2007. No. 42. 109 p.
110. Чумиков И.А., Скрябин К.Г., Спиридонов Ю.Я. (ред.). Технология Либерти Линк фирмы Авентис Кропсайенс— новый инструмент для успешной борьбы с сорняками // Современные направления борьбы с сорняками с использованием новых классов гербицидов и трансгенных растений, устойчивых к гербицидам. М.: Центр «Биоинженерия», РАН, 2001. Т. 2. С. 77–79.
111. Cremer J.The performance of liberty in GM Libertylink crops (maize, osr and sugar beet) as a broad spectrum herbicide in Europe (experience from 10 years testing) // Современные направления борьбы с сорняками с использованием новых классов гербицидов и трансгенных растений, устойчивых к гербицидам / под ред. К.Г. Скрябина, Ю.Я. Спиридонова. М.: Центр «Биоинженерия», РАН, 2001. Т. 2. С. 89–96.
112. Технический регламент Таможенного союза. О безопасности пищевой продукции. ТР ТС 021/2011. Утв. решением Комиссии Таможенного союза от 9 декабря 2011 г. № 880.
113. Технический регламент Таможенного союза. О безопасности зерна. ТР ТС 015/2011. Утв. решением Комиссии Таможенного союза от 9 декабря 2011 г. № 874.
114. Принципы оценки риска для потомства в связи с воздействием химических веществ в период беременности. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Вып. 30. Женева: МПХБ/ВОЗ, 1988. 156с.
115. Marty M.S., Allen B., Chapin R.E., Cooper R.E. et al. Inter-laboratory control data for reproductive endpoints required in the OPPTS 870.3800. OECD 416 reproduction and fertility test // Br. Defects Res. B. 2009. Vol.86. P. 470–489.
116. Давыдовский И.В. Приспособительные процессы в патологии // Вестн. АМН СССР. 1962. № 4. С. 27–37.
117. Саноцкий И.В., Уланова И.П. Критерии вредности в гигиене и токсикологии, при оценке опасности химических соединений. М.: Медицина, 1975. 328 с.
118. Остин К., Шорт Р. Гормональная регуляция размножения у млекопитающих. М.: Мир, 1987. 305 с.
119. Mandl A.M. The Phases of the oestrous cycle in the adult white rat // J. Exp. Biol. 1951. Vol. 28. P. 576–584.
120. Roste L.S., Tauboll E., Isojarvi J.I. еt аl. Gonadal morphology and sex hormones in male and female Wistar rats after long-term lamotrigine treatment // Seizure. 2003. Vol. 12. P. 621–627.
121. Bridges R.S., Todd R.B., Logue C.M. Serum concentrations of testosterone throughout pregnancy in rats // J. Endocrinol. 1982. Vol. 94. P. 21–27.
122. Mukaddam-Daher S., Jankowski M., Wang D. et al. Regulation of cardiac oxytocin system and natriuretic peptide during rat gestation and postpartum // J. Endocrinol. 2002. Vol. 175. P. 211–216.
123. Weizenbaum F.A. Serum testosterone concentrations in the pregnant rat // J. Steroid Biochem. 1979. Vol. 10. P. 71.
124. Aoyama H., Kikuta M., Shirasaka N., Hojo H. et al. Historical control data on reproductive abilities and incidences of spontaneous fetal malformations in Wistar Hannover GALAS rats // Congenit. Anom. 2002. Vol. 42. P. 194–201.
125. Ema M., Itami T., Kawasaki H. Embryolethality and teratogenicity of butyl benzyl phthalate in rats // J. Appl. Toxicol. 1992. Vol. 12, N 3. P. 179–183.
126. Griffiths J.C., Borzelleca J.F., Cyr J.S. Lack of oral embryotoxicity/teratogenicity with D-ribose in Wistar rats // Food Chem. Toxicol. 2007. Vol. 45. P. 388–395.
127. Liberati T.A., Roe B.J., Feuston M.H. An oral (gavage) control embryo-fetal development study in the Wistar Hannover rat // Drug Chem. Toxicol. 2002. Vol. 25, N 1. P. 109–130.
128. Noda T. Maternal and fetal toxicity of dimethyltin in rats // J. Health Sci. 2001. Vol. 47, N 6. P. 544–551.
129. Saito F.H., Damasceno D.C., Kempinas G.W., Morceli G. et al. Repercussions of mild diabetes on pregnancy in Wistar rats and on the fetal development // Diabetol. Metab. Syndr. 2010. Vol. 2, N 1. P. 26.
130. Jurevics H.A., Kidwai F.Z., Morell P. Sources of cholesterol during development of the rat fetus and fetal organs // J. Lipid Res. 1997. Vol. 38. P. 723–733.
131. Pullen A.H. A parametric analysis of the growing CFHB (Wistar) rat // J. Anat. 1976. Vol. 121. P. 371–383.
132. Schneidereit M. Study of fetal organ growth in Wistar rats from day 17 to 21 // Lab. Anim. 1985. Vol.19. P. 240–244.
133. Акимова И.М. Аномалии развития скелета эмбрионов крыс после воздействия хлоридина (пириметамина)// Арх. анат. 1972. № 8. С. 77–86.
134. Дыбан А.П., Баранов В.С., Акимова И.М. Основные методические подходы к тестированию тератогенной активности химических веществ // Арх. анат. 1970. № 10. С. 89–100.
135. Raouf A.R., Omar M.M. Effects of melatonin on the teratogenicity of alcohol in albino rat // Suez Canal Univ. Med. J. 1999. Vol. 2, N 2. Р. 173–186.
136. Ganiger S., Malleshappa H.N., Krishnappa H., Rajashekhar G. et al. A two generation reproductive toxicity study with curcumin, turmeric yellow, in Wistar rats // Food Chem. Toxicol. 2007. Vol. 45. P. 64–69.
137. Ohi M., Dalsenter P.R., Andrade A.J.M., Nascimento A.J. Reproductive adverse effects of fipronil in Wistar rats // Toxicol. Lett. 2004. Vol. 146. P. 121–127.
138. Hood R.D. Developmental and Reproductive Toxicology: A Practical Approach. 2nd ed. USA: CRC Press, 2006.
139. Okamura T., Suzuki S., Ogawa T. et al. Background data for general toxicology parameters in RccHan:WIST rats at 8, 10, 19 and 32 weeks of age // J. Toxicol. Pathol. 2011. Vol. 24. Р. 195–205.
140. Пендина А.А., Гринкевич В.В., Кузнецова Т.В. и др.Метилирование ДНК — универсальный механизм регуляции активности генов // Экол. генетика. 2004. Т. 1, № II. С. 27–37.
141. Cross S.H., Bird A.P. CpG islands and genes // Curr. Opin. Genet. Dev. 1995. Vol. 5, N 3. Р. 309–314.
142. Kelsey G., Feil R. New insights into establishment and maintenance of DNA methylation imprints in mammals // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2013. Vol. 368. Article ID 20110336.
143. Jones M.J., Goodman S.J., Kobor M.S. DNA methylation and healthy human aging  // Aging Cell. 2015. Vol.14, N 6. P. 924–932.
144. Киселева Н.П. Деметилирование ДНК и канцерогенез// Биохимия. 2005. Т. 70, № 7. C. 900–911.
145. Widschwendter M., Apostolidou S., Raum E. et al. Epigenotyping in peripheral blood cell DNA and breast cancer risk: a proof of principle study // PLoS One. 2008. Vol. 3, N 7. Article ID 0002656.
146. Yener Z., Celik I., Ilhan F. et al. Effects of Urtica dioica L. seed on lipid peroxidation, antioxidants and liver pathology in aflatoxin-induced tissue injury in rats // Food Chem. Toxicol. 2009. Vol. 47, N 2. P. 418–424.
147. Sun L.H., Lei M.Y., Zhang N.Y. et al. Individual and combined cytotoxic effects of aflatoxin B1, zearalenone, deoxynivalenol and fumonisin B1 on BRL 3A rat liver cells // Toxicon. 2015. Vol. 95. P. 6–12.
148. El-Mansy A.A., Mazroa S.A., Hamed W.S. et al. Histological and immunohistochemical effects of Curcuma longa on activation of rat hepatic stellate cells after cadmium induced hepatotoxicity // Biotech. Histochem. 2016. Vol. 91, N 3. P. 170–181.
149. Federico A., Tiso A., Loguercio C. A case of hepatotoxicity caused by green tea // Free Radic. Biol. Med. 2007. Vol. 43. P. 474.
150. Thangapandiyan S., Miltonprabu S. Epigallocatechin gallate effectively ameliorates fluoride-induced oxidative stress and DNA damage in the liver of rats // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2013. Vol. 91, N 7. P. 528–537.
151. Ataseven N., Yüzbaşıoğlu D., Keskin A.Ç. et al. Genotoxicity of monosodium glutamate // Food Chem. Toxicol. 2016. Vol. 91. P. 8–18.
152. Onyema O.O, Farombi E.O., Emerole G.O. et al. Effect of vitamin E on monosodium glutamate induced hepatotoxicity and oxidative stress in rats // Indian J. Biochem. Biophys. 2006. Vol. 43, N 1. P. 20–24.
153. Mahmoud Y.I., Mahmoud A.A. Role of nicotinamide (vitamin B3) in acetaminophen-induced changes in rat liver: Nicotinamide effect in acetaminophen-damged liver  // Exp. Toxicol. Pathol. 2016. Vol. 68, N 6. P. 345–354.
154. Sarges P., Steinberg J.M., Lewis J.H. Drug-induced liver injury: highlights from a review of the 2015 literature // Drug Saf. 2016. Vol. 39, N 5. Article ID 01145916.
155. Sae-Tan S., Grove K.A., Kennett M.J. et al. (–)-Epigallocatechin-3-gallate increases the expression of genes related to fat oxidation in the skeletal muscle of high fat-fed mice // Food Funct. 2011. Vol. 2. P. 111–116.
156. Seguí N., Mina L.B., Lázaro C. et al. Germline mutations in FAN1 cause hereditary colorectal cancer by Impairing DNA repair // Gastroenterology. 2015. Vol. 149, N 3. P. 563–566.
157. Theofilopoulos S., Lykidis A., Leondaritis G. et al. Novel function of the human presqualene diphosphate phosphatase as a type II phosphatidate phosphatase in phosphatidylcholine and triacylglyceride biosynthesis pathways // Biochim. Biophys. Acta. 2008. Vol. 178, N 11. P. 731–742.
158. Lhotska H., Zemanova Z., Cechova H. et al. Genetic and epigenetic characterization of low-grade gliomas reveals frequent methylation of the MLH3 gene // Gene Chromosome Cancr. 2015. Vol. 54, N 11. P. 655–667.
159. Kim W., Kim J.E. SIRT7 anemerging sirtuin: deciphering newerroles // J. Physiol. Pharmacol. 2013. Vol. 64, N 5. P. 531–534.
160. Kim J.K., Noh J.H., Jung K.H. et al. Sirtuin7 oncogenic potential in human hepatocellular carcinoma and its regulation by the tumor suppressors MiR-125a-5p and MiR-125b // Hepatology. 2013. Vol. 57. P. 1055–1067.
161. Chen B.B., Coon T.A., Glasser J.R. et al. E3 ligase subunit Fbxo15 and PINK1 kinase regulate cardiolipin synthase 1 stability and mitochondrial function in pneumonia // Cell Rep. 2014. Vol. 7, N 2. P. 476.
162. Jiang X., Nevins J.R., Shats I. et al. E2F1-mediated induction of NFYB attenuates apoptosis via joint regulation of a pro-survival transcriptional program // PLoS One. 2015. Vol. 10, N 6. Article ID e0127951.
163. Miller C., Saada A., Shaul N. et al. Defective mitochondrial translation caused by a ribosomal protein (MRPS16) mutation // Ann. Neurol. 2004. Vol.56, N 5. P. 734.
164. Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления. ГОСТ 7.32-2001. Взамен ГОСТ 7.32-91. Введ. 30.06.2002 .
165. База данных SWISS-PROT [Электронный ресурс]. URL: http://www.uniprot.org/uniprot/?query=*&fil=reviewed%3Ayes
166. База данных TrEMBL [Электронный ресурс]. URL: http://www.uniprot.org/uniprot/?query=*&fil=reviewed%3Ano.
167. База данных PIR [Электронный ресурс]. URL: http://pir.georgetown.edu/
168. База данных GenBank [Электронный ресурс]. URL: http://www/ncbi/nlm/nih.gov.
169. Меньшиков В.В. (ред.). Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987. 368 с.
170. Weingard K., Brown R.G., Hall et al. Harmonization of animal clinical pathology testing in toxicity and safety studies. The Joint Scientific Committee for International Harmonization of Clinical Pathology Testing // Fundam. Appl. Toxicol. 1996. Vol.29. P. 198–201.
171. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и суперок-сиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа // Вопр. мед. химии. 1994. № 2. С. 56–58.
172. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А. Оптимизация определения активности глутатионредуктазы эритроцитов человека на полуавтоматическом анализаторе// Вопр. мед. химии. 1994. № 2. С. 59–61.
173. Mills G.C. The purification and properties of glutathione peroxidase of erythrocytes // J. Biol. Chem. 1959. Vol. 234, N 3. P. 502–506.
174. Niashikimi M., Rao N., Jagi K. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. Vol. 46. P. 849–854.
175. Oshino N., Chance B. Analysis of the catalase-hydrogen peroxide intermediate in coupled oxidations // Arch. Biochem. Biophys. 1973.Vol. 154, N 1. P. 117–131.
176. Tillotson J.A., Sauberlich H.E. Effect of riboflavin depletion and repletion on the erythrocyte glutathione reductase in the rat // J. Nutr. 1971. Vol. 101. P. 1459–1466.
177. Burchell B., Weatherill P. 4-Nitrophenol UDP-glucuronyltransferase (rat liver) // Methods Enzymol. 1981. Vol. 77. P. 169–176.
178. Burke M.D., Mayer R.T. Differential effects of phenobarbitone and 3-methylcholanthrene induction on the hepatic microsomal metabolism and cytochrome P-450-binding of phenoxazone and a homologous series of its n-alkyl ethers (alkoxyresorufins) // Chem. Biol. Interact. 1983. Vol. 45. P. 243–258.
179. Habig W.H., Pabst M.J., Jacoby W.B. Glutathione S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation // J. Biol. Chem. 1974. Vol. 294. P.7130–7139.
180. Omura T., Sato R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature // Biol. Chem. 1964. Vol. 239. P. 2370–2378.
181. Umegaki K., Saito K., Kubota Y. et al. Ginkgo biloba extract markedly induces pentoxyresorufin O-dealkylase activity in rats // Jpn. J. Pharmacol. 2002. Vol. 90. P. 345–351.
182. Дингл Дж. Лизосомы. Методы исследования. М.: Мир, 1980. 344с.
183. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия // Руководство. М.: Медицина, 1990. 384 с.
184. Западнюк И.П. и др. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. 3-еизд. Киев: Выща школа, 1983. 383 с.
185. Киселева А.Ф., Житников А.Я., Кейсевич Л.В. Морфофункциональные методы исследования в норме и при патологии. Киев: Здоровье, 1983. 163 с.
186. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М.: Мир, 1982. 272 с
187. Луппа Х. Основы гистохимии. М.: Мир, 1980. 343 с.
188. Микроскопическая техника: руководство / под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. М.: Медицина, 1996. 544 с.
189. Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы. СПб.: Лань, 2001. 464 с.
190. Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия: в 2т. М.: Медицина, 2000. 1944 с.
191. Полак Д., Норден С.В. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М.: Мир, 1987. 74 с.
192. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. М.: Медицина, 1993. 688 с.
193. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012. Т. 1. 944 c.
194. FAO/WHO Protein Quality Evaluation. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation Held in Bethesda, Md, USA, 4–8 December 1989. Rome: FAO, 1989. 2p.
195. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зебрев А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов (методические рекомендации)// Ведомости фармакологического комитета. 1999. № 1. С. 31–36.
196. Stokes C.R., Miller B.G., Bourne F.J. Animal models of food sensitivity // Food Allergy and Intolerance. London, 1987. P. 286–300.
197. Weigle W., Cochrane C., Dixon F. Anaphylactogenic hroherties of soluble antigen-antibody complexes in the guinea pigs and rabbits  // J. Immunol. 1960. Vol.85. P. 469–477.
198. Гмошинский И.В., Кржечковская В.В., Пятницкий Н.Н. Определение антител класса IgG у экспериментальных животных, сенсибилизированных перорально пищевым белком (к характеристике модели пищевой анафилаксии) // Вопр. питания. 1994. № 1–2. С. 30–33.
199. Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Анисина Е.А., Сиднева Е.С. и др. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: методические рекомендации. М., 2006. 28 с.
200. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками. Методические указания МУ 2.3.2.3388-16.
201. Тутельян В.А. (ред.) Генетически модифицированные источники пищи: оценка безопасности и контроль. М.: Изд-во РАМН, 2007. 444 с.
202. Perlak F.J., Deaton R.W., Armstrong T.A., Sims S.R. et al. Insect resistant cotton plants // Biotechnology. 1990. Vol. 8. P. 939–943.
203. Perlak F.J., Fuchs R.L., Dean D.A., McPherson S.L. Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 3324–3328.
204. Shan D.M. C.M.T. Rommens, R.N. Beachy Resistance to diseases and insects in transgenetic plants: progress and application to agriculture // Trends Biotechnol. 1995. Vol. 13. P.362–368.
205. Yoshizawa T., Kohno H., Ikeda K., Shinoda T. et al. A practical method for measuring deoxynivalenol, nivalenol, and T–2+HT–2 toxin in foods by an enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004. Vol. 68. P. 2076–2085.
206. Скрябин К.Г., Новожилов К.В. (ред.). Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку. М.: Наука, 2000. Т. 1. 224 с.
207. Kumar A. P., Sharma R.P., Malik V.S. The insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis// Adv. Appl. Microbiol. 1996. Vol. 42. P. 1–43.
208. Гулина И.В., Шульга О.А., Миронов М.В. и др. Экспрессия частично модифицированного гена дельта-эндотоксина из Basillus thurinciensis var. tenebrionis в трансгенных растениях картофеля // Молекул. биол. 1994. Т. 28, № 5. С. 1166–1175.
209. Brunke K.J., Meeusen R.L. Insect control with genetically engineered crops // Trends Biotechnol. 1991. Vol. 9. P. 197–200.
210. Cheng J., Bolyard M.G., Saxena R.C., Sticklen M.B. Production of insect resistant potato by genetic-transformation with a delta-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis var Kurstaki // Plant Sci. 1992. Vol. 81. 83–91.
211. AOAC Official Method 995.15. Fumonisins B1, B2, and B3 in corn, Liquid Chromatographic Method // Chapter 49: Subchapter 5. AOAC International 2002. 17th ed. Current Through Revision No. 1, 2002 / ed. William Horwitz.
212. EFSA Panel on Genetically Modified Organisms. Scientific Opinion on application (EFSA-GMO-NL–2009-73) for the placing on the market of insect-resistant and herbicide-tolerant genetically modified soybean MON87701×MON89788 for food and feed uses, import and processing under Regulation (EC) No. 1829/2003 from Monsanto // EFSA J. 2012. Vol. 10 (2560). 34 p.
213. Consensus document on compositional considerations for new varieties of soybean: key food and feed nutrients and anti-nutrients. Series on the Safety of Novel Foods and Feeds, No. 2. OECD Environment Directorate. 2001. 30 p.
214. База данных International Life Science Institute (ILSI). ILSI Crop Composition Database Version 2.0. Jan. 18, 2006. URL: http:// www.cropcomposition.org; Search criteria: soybean seed, all locations, all years.
215. Lundry D.R., Ridley W.P., Meyer J.J., Riordan S.G. et al. Composition of grain, forage, and processed fractions from second-generation glyphosate-tolerant soybean, MON 89788, is equivalent to that of conventional soybean (Glycine max L.) // J. Agric. Food Chem. 2008. Vol. 56, N 12. Р. 4611–4622.
216. Harrison L.A., Bailey M.W., Naylor J.E., Ream B.J. et al. The expressed protein in glyphosate-tolerant soybean, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Agrobacterium sp. strain CP4, is rapidly digested in vitro and is not toxic to acutely gavaged mice // J. Nutr. 1996. Vol. 126. P. 728–740.
217. Nutrient Requirements of Poultry. 9th rev. ed. Washington, DC: National Academy Press, 1994. 
218. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. СанПиН 2.3.2.1078-01. Введ. 14.11.2001.
219. Масло соевое. Технические условия. ГОСТ Р 53510-2009. Введ. 01.01.2011.
220. Мука соевая дезодорированная. Технические условия. ГОСТ 3898-56. Введ. 01.01.1957.
221. Порядок и методы идентификации и количественного определения в пищевых продуктах ГМО, полученных с использованием новых биотехнологий. Методические рекомендации. МУК 4.2.3105-13.
222. Детекция и идентификация ГМО растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции в матричном формате. Методические рекомендации МУК 4.2.3390-16.
223. Федеральный закон «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности». ФЗ № 86. Введ. 05.07.1996 г.
224. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Введ. 01.11.2002.
225. База данных Center for Enviromental Risk Assessment [Электронный ресурс]. URL: http://cera-gmc.org/GMCropDatabase. (дата обращения: 3.10.2016)
226. База данных GMOseek project [Электронный ресурс]. URL: http://www.gmoseek.com/gmoseek. (дата обращения: 03.10.2016)
227. Валидация методов, предназначенных для выявления и идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов в пищевых продуктах и продовольственном сырье. Методические указания МУК 4.2.3389-16.
228. Осуществление надзора за производством и оборотом пищевых продуктов, содержащих ГМО. Методические указания МУК 4.2.2304-07 // Методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения: сборник методических указаний. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. Ч. 1.
229. База данных Event-specific method for the quantification of maize line MON 89034 using real-time PCR, European Commission, Joint Research Centre, 2008 [Электронный ресурс]. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/MON89034_validated_Method.pdfю
230. База данных Event 5307 Maize. Real-time, Event-specific Polymerase Chain Reaction Method, European Commission, Joint Research Centre, 2014 [Электронный ресурс]. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL–07–11VR_Maize%205307%20final%20report.pdf.
231. База данных Event-specific method for the quantification of maize line TC1507 using real-time PCR, European Commission, Joint Research Centre, 2005 [Электронный ресурс]. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/TC1507-report_mm.pdf.
232. База данных Event-specific method for the quantification of soybean SYHT0H2 by real-time PCR, European Commission, Joint Research Centre, 2016 [Электронный ресурс]. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL–04–12-VP.pdf.
233. Методы идентификации и количественного определения новых линий ГМО 2-го поколения в пищевых продуктах. Методические указания МУК 4.2.3309-15.
234. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002. Ч. 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений. М.: Госстандарт России, 2002. 32 с.
235. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. ГОСТ Р 53244-2008 (ИСО 21570:2005). М.: Стандартинформ, 2009. 60 с.
236. Государственный доклад. О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2014 году. М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2015. 206 с.
237. Directive on the Deliberate Release into the Environment of Genetically Modified Organisms (2001/18)];
238. Regulation on Genetically Modified Food and Feed (1829/2003).